促进细胞凋亡的自噬作用介导了不对称双吖啶类药物在胰腺癌细胞中的抗迁移效应

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Apoptosis-promoting autophagy mediates anti-migratory effects of unsymmetrical bisacridines in pancreatic cancer cells

不对称双吡啶衍生物（C-2028、C-2045、C-2053）通过诱导自噬与凋亡协同作用显著抑制胰腺癌（PC）细胞增殖并抑制迁移，同时保持对正常细胞低毒性，提示其作为潜在抗癌药物的价值。

　　胰腺癌（Pancreatic Cancer, PC）是一种极具侵袭性的恶性肿瘤，全球范围内位列第11位常见的癌症类型，其特点是早期转移和对标准化疗的高耐药性。这些特性导致当前治疗方案的效果有限，尽管多药联合治疗如FOLFIRINOX（氟尿嘧啶、亚叶酸钙、伊立替康和奥沙利铂）、NALIRIFOX（氟尿嘧啶、亚叶酸钙、脂质体伊立替康和奥沙利铂）以及GEM-NABP（吉西他滨与白蛋白结合型紫杉醇）已部分改善患者的生存率，但这些方案仍受限于其高毒性及不良反应。因此，迫切需要发现具有更高选择性和能够克服耐药机制的新化合物。

研究团队在波兰的格但斯克理工大学对一系列不对称双吖啶类化合物（Unsymmetrical Bisacridines, UAs）进行了开发和研究，发现这些化合物对胰腺癌细胞具有显著的抗肿瘤活性，而对正常细胞的毒性则相对较低。该研究进一步探讨了UAs对胰腺癌细胞中自噬（Autophagy）的影响，以及自噬与细胞凋亡（Apoptosis）和迁移（Migration）之间的相互作用。自噬在肿瘤进展中扮演着复杂角色，尤其在胰腺癌中与较差的预后相关。因此，研究的目标是评估UAs对自噬及其与凋亡和迁移的交互作用，以进一步探索其在胰腺癌治疗中的潜力。

研究中测试了三种UA衍生物（C-2028、C-2045和C-2053）对胰腺癌细胞系（Panc-1、MIA PaCa-2、AsPC-1和BxPC-3）及正常细胞系（hTERT-HPNE）的影响。生物评估包括细胞活力（MTT）、凋亡（Annexin V-FITC、caspase 3/7及细胞核染色）和自噬（酸性细胞器染色和分子标志物）等方面。同时，细胞迁移及相关分子标志物也被分析。结果显示，UA衍生物在胰腺癌细胞中表现出显著的细胞毒性，并诱导更高的凋亡水平，而在正常细胞中则相对温和。此外，UA诱导的自噬具有细胞系依赖性，并且不依赖于Beclin1。自噬与凋亡之间的关系复杂，但总体上倾向于促进细胞死亡。所有UA衍生物均显著抑制了胰腺癌细胞的迁移，其抗迁移效应与自噬活性相关。这些发现表明，UA衍生物通过自噬途径对胰腺癌细胞具有双重的促凋亡和抗迁移效应。它们对正常胰腺细胞的较低毒性支持了其作为胰腺癌治疗候选药物的进一步开发潜力。

研究表明，UA衍生物在多种人类肿瘤细胞系中均显示出较强的细胞毒性，包括胰腺、肺和结肠癌，而对正常细胞的毒性则显著降低。这表明UA具有良好的选择性，可能成为新型抗肿瘤药物。这些化合物的结构差异，如甲基和羟基取代基的存在与否，可能影响其物理化学性质和代谢稳定性。值得注意的是，C-2045是唯一一个能够进行葡糖醛酸化代谢的UA衍生物，而C-2045和C-2053则能够抑制CYP3A4，这是负责异源物质代谢的主要P450同工酶。相比之下，C-2028则能够抑制UGT1A1和UGT2B7，这表明不同结构的UA可能通过不同的代谢途径发挥作用。

在胰腺癌细胞中，UA衍生物通过c-Myc蛋白的下调诱导凋亡，这种效应在三维细胞培养模型中也得到了验证。三维模型更准确地反映了肿瘤微环境，显示出UA在复杂细胞环境中仍能维持其促凋亡活性。然而，不同胰腺癌细胞系对这些化合物的敏感性存在差异，这可能与它们的结构特征有关，如细胞摄取能力、代谢稳定性或G-四链体稳定化的效率。

自噬与凋亡之间的关系是复杂的，但总体上，自噬可以促进细胞死亡。例如，El Mahi的研究表明，Rhus coriaria提取物通过survivin蛋白的下调诱导自噬，从而支持凋亡。相反，在Sonodynamic Therapy的研究中，Du等人发现自噬的抑制反而加速了凋亡。这说明自噬在不同治疗环境下可能具有不同的作用，可能在某些情况下促进细胞存活，而在其他情况下促进细胞死亡。自噬的关键标志物是LC3蛋白，它在自噬体形成过程中起重要作用。LC3-I在细胞质中被裂解后，通过与磷乙醇胺结合形成LC3-II，并整合到自噬体膜中。另一个关键蛋白p62则与泛素化货物结合，引导其进入自噬体进行降解。因此，p62的积累或清除可作为自噬通量的指标。

在胰腺癌中，自噬通常被上调，与增强的细胞存活、转移和对治疗的抵抗有关。尽管在早期肿瘤发生中自噬可能起到抑癌作用，但在已建立的肿瘤如胰腺癌中，自噬往往支持细胞对代谢应激和缺氧的适应。因此，自噬在胰腺癌细胞对化疗药物的反应中仍存在争议，并且其作用高度依赖于具体情境。

自噬还对细胞迁移具有双重影响，既可能促进也可能抑制迁移。考虑到细胞迁移是胰腺癌转移过程中的早期和关键步骤，理解自噬如何调节这一过程对于设计新的治疗策略以限制肿瘤扩散至关重要。除了促凋亡作用外，抗迁移效应在设计有效的胰腺癌治疗方案中同样具有重要意义，因为胰腺癌具有高度侵袭性和转移能力。上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）是转移的重要因素，主要促进癌细胞的快速侵袭、迁移和耐药性。EMT通过减少上皮标志物（如E-cadherin）的表达，增加间质标志物（如N-cadherin和vimentin）的表达，从而促进迁移和侵袭。

鉴于自噬在调节胰腺癌细胞凋亡和迁移中的关键作用，本研究旨在评估三种UA衍生物对胰腺癌细胞的影响。此外，还研究了这些化合物在正常胰腺细胞中的促凋亡作用。通过分析细胞活力、凋亡、自噬及迁移，以及相关的分子标志物，进一步探讨了自噬在UA诱导的细胞反应中的功能角色。通过使用自噬抑制剂，更深入地理解了自噬在UA作用中的贡献。

研究结果显示，UA衍生物在所有四种胰腺癌细胞系中均诱导了自噬，尽管不同细胞系的诱导程度和作用机制存在差异。在Panc-1和AsPC-1细胞中，自噬主要表现为促死亡，而在BxPC-3细胞中则表现出部分保护性作用。MIA PaCa-2细胞则表现出中等效果，这可能与其对凋亡和自噬诱导的双重反应有关。尽管各细胞系中Beclin1和Bcl-2的调控存在差异，但所有UA衍生物均通过Beclin1独立的机制诱导自噬。这一发现表明，UA可能通过非经典的自噬激活途径起作用，这在肿瘤生物学中正逐渐受到重视，可能为具有缺陷经典自噬通路的肿瘤提供治疗优势。

在胰腺癌细胞中，自噬具有双重作用，其影响因细胞系而异。例如，在BxPC-3细胞中，自噬抑制剂（尤其是氯喹）增强了C-2053的细胞毒性和促凋亡作用，表明自噬在这些细胞中可能起到保护作用。相反，在Panc-1和AsPC-1细胞中，自噬的抑制减少了UA诱导的凋亡，表明UA通过促死亡的自噬机制起作用，这是理想的治疗策略。在MIA PaCa-2细胞中，只有氯喹的联合治疗增强了UA的促凋亡作用，而wortmannin和NH4Cl的联合治疗则显著降低了C-2028的活性。这一现象表明，UA在某些细胞系中需要特定的自噬通路阻断才能发挥其最大效应。此外，UA在MIA PaCa-2细胞中诱导的自噬功能障碍可能与加速细胞衰老有关，这可能通过上调p21蛋白实现。细胞衰老后，这些细胞可能进一步转化为凋亡，这与之前的研究结果一致，表明受损的自噬可能通过积累损伤的细胞成分，干扰细胞代谢，从而导致细胞衰老。

在细胞迁移方面，UA衍生物在胰腺癌细胞中表现出显著的抗迁移作用，且其效果强于标准化疗药物。例如，MIA PaCa-2和BxPC-3细胞在UA治疗后迁移受到最显著抑制。此外，EMT相关蛋白的分析表明，UA可能通过非经典途径影响细胞迁移，例如通过干扰细胞骨架动力学、影响整合素或粘附信号通路，或改变迁移促进因子的分泌，从而抑制迁移。值得注意的是，虽然EMT相关蛋白的表达可能发生变化，但这些变化并不总是导致迁移能力的降低，这表明UA的抗迁移效应可能通过多种机制实现，而不仅仅是通过EMT。

本研究还发现，自噬的抑制可能增强UA的抗迁移作用，表明自噬在胰腺癌细胞迁移中具有抑制作用。例如，当使用自噬抑制剂时，Panc-1、MIA PaCa-2和AsPC-1细胞的迁移能力显著增强，而BxPC-3细胞的迁移能力则相对较低。这些结果表明，自噬在胰腺癌细胞迁移中可能发挥着复杂的调节作用，这与一些其他研究中的发现一致，如在RAS突变的癌细胞中，自噬的抑制可能促进上皮-间质转化和侵袭，通过破坏上皮完整性并增强间质特征。

综上所述，本研究揭示了UA衍生物在胰腺癌细胞中的多重作用机制，包括通过促凋亡和抗迁移效应，以及通过非经典的自噬诱导途径。这些化合物显示出对胰腺癌细胞的高度选择性，同时对正常细胞的毒性较低，支持其作为胰腺癌治疗候选药物的潜力。此外，UA可能通过多种分子机制，如G-四链体稳定化、c-Myc蛋白下调和自噬调控，对胰腺癌细胞产生显著的抗癌效果。这些发现为未来胰腺癌治疗策略的开发提供了重要的理论基础和实验依据。