综述：从染料排除法到高通量筛选：细胞活力检测方法及其应用综述

《Biotechnology Advances》：From dye exclusion to high-throughput screening: A review of cell viability assays and their applications

细胞存活实验（CVA）分类及选择策略研究。系统综述膜完整性、代谢活性、凋亡/坏死及增殖四大类CVA的原理、应用及局限，提出基于实验目标的动态选择决策树，强调多模式检测和3D细胞模型对提高评估精准度的作用，为生物医药研发和毒理学评估提供方法优化方案。

　　细胞活力检测（Cell Viability Assays, CVAs）是细胞生物学、生物医学研究、药物开发和生物技术领域中广泛应用的技术手段，其核心功能在于评估细胞在不同条件下的健康状况、增殖能力、细胞毒性以及功能活动。随着研究的深入和实验需求的多样化，CVAs的应用范围不断扩展，从基础的细胞培养监控发展到药物筛选、毒理学研究、免疫学、疫苗开发、干细胞研究以及再生医学等多个方向。此外，CVAs在工业和制药生物技术中的应用也日益重要，例如在生物制造和生物过程监控中，细胞活力和细胞浓度直接决定了产物的产量和质量。在农业生物技术中，CVAs被用于评估除草剂的细胞毒性、植物细胞健康状况和益生菌的稳定性。环境毒理学领域则利用CVAs来研究污染物对哺乳动物和鱼类细胞系的影响，从而为生态风险评估提供数据支持。然而，尽管CVAs有着悠久的历史和广泛的应用，研究人员在选择合适的检测方法时仍面临诸多挑战。

在传统细胞活力检测方法中，显微镜下的染色排除法是最基础且广泛使用的技术之一。该方法的核心原理是基于细胞膜的完整性：活细胞的细胞膜保持完整，能够阻止某些染料（如Trypan Blue和Erythrosine B）进入细胞内部，而死细胞或受损细胞的膜通透性增加，染料可以渗透到细胞内并与其结合，从而在显微镜下呈现出明显的颜色变化。这一方法虽然操作简便，但在实际应用中存在明显的局限性，例如对细胞膜损伤的识别不够精确，难以区分凋亡和坏死等不同形式的细胞死亡，且容易受到细胞碎片或培养基成分的干扰，导致假阳性和假阴性结果。此外，染色排除法的灵敏度较低，无法有效检测微小的细胞活力变化，从而可能影响实验结果的准确性。

随着技术的进步，现代CVAs逐渐发展出多种更先进的检测方法，包括比色法、荧光法、发光法以及流式细胞术等。这些方法在灵敏度、特异性和通量方面都有显著提升，能够更全面地反映细胞活力的动态变化。例如，比色法检测如MTT、XTT和WST等方法，能够通过检测细胞代谢产物的光吸收特性来评估细胞活力，但其灵敏度受到氧化还原反应和化合物干扰的影响，且对代谢活动的波动较为敏感，可能无法准确区分早期代谢变化与细胞死亡。相比之下，荧光法检测则利用荧光染料与细胞内特定分子的结合特性，提供更高的灵敏度和多参数检测能力，例如YOYO-1、碘化丙啶（PI）和7-氨基放线菌素D（7-AAD）等荧光染料能够特异性地识别细胞膜受损后暴露的DNA，从而提供更精确的细胞活力评估。然而，荧光法检测需要专门的高成本仪器，且存在光毒性风险，可能对细胞本身造成额外的损伤。

发光法检测则在灵敏度和检测速度方面表现出色，成为实时细胞活力评估的重要工具。该方法通过检测细胞内特定酶反应的发光信号，能够快速、定量地反映细胞活力的变化。然而，发光法的局限性在于其对实验条件的依赖性较强，例如培养基成分、细胞密度以及温度等因素都可能影响检测结果的准确性。流式细胞术则提供了单细胞层面的多参数分析能力，能够同时检测细胞膜不对称性、通透性、线粒体功能等指标，从而更全面地评估细胞死亡的不同机制。例如，通过检测磷脂酰丝氨酸的外翻（Annexin V结合）和半胱天冬酶的激活，研究人员可以区分凋亡和坏死等不同的细胞死亡形式。然而，流式细胞术的操作流程较为复杂，对设备和技术人员的要求较高，且成本相对较高。

为了更有效地选择适合的CVAs，研究者需要根据实验的具体目标和需求，对不同的检测方法进行综合评估。细胞活力检测方法可以按照其检测的细胞基本特性进行分类，而不是仅仅依据所使用的仪器或检测模式。这种分类方法能够帮助研究人员更精准地匹配实验需求，确保检测结果的生物学意义。目前，CVAs主要分为四类：膜完整性检测、代谢活性检测、凋亡检测以及增殖和生物量检测。每种检测方法都有其独特的适用场景和局限性，因此，合理的选择不仅依赖于技术参数，还需要考虑实验设计的科学性和数据的可靠性。

膜完整性检测主要通过检测细胞膜的通透性来评估细胞活力，其原理是活细胞的膜保持完整，而死细胞或受损细胞的膜通透性增加，从而允许特定染料进入细胞内部。这一类检测方法包括染色排除法和基于细胞内酶泄漏的检测方法，如乳酸脱氢酶（LDH）释放检测。染色排除法虽然操作简便，但其灵敏度较低，且难以区分不同形式的细胞死亡。相比之下，基于酶泄漏的检测方法能够更准确地反映细胞膜的破坏程度，但其检测结果可能受到其他因素的影响，例如细胞裂解的程度和检测时间的选择。

代谢活性检测则通过评估细胞内的代谢活动来间接反映细胞活力，例如检测线粒体功能、细胞内酶活性以及ATP水平等。这类检测方法能够捕捉细胞早期代谢变化，从而提供更早的细胞死亡预警。然而，代谢活性的变化可能受到多种生理和病理因素的影响，例如细胞应激、营养缺乏或药物作用等，因此，代谢活性检测结果可能并不完全等同于细胞死亡的直接证据。此外，代谢活性检测的敏感性较高，但其结果可能受到实验条件的干扰，例如培养基成分的变化或细胞代谢状态的波动，因此，需要谨慎解读检测数据。

凋亡检测则是评估细胞程序性死亡的一种重要手段，能够识别凋亡过程中的关键标志物，如磷脂酰丝氨酸的外翻、半胱天冬酶的激活、线粒体膜电位的丧失以及DNA断裂等。这类检测方法通常依赖于荧光或流式细胞术，能够提供更精确的细胞死亡类型信息。然而，凋亡检测的局限性在于其对实验条件的依赖性较强，例如细胞类型、凋亡诱导剂的浓度以及检测时间的选择都会影响结果的准确性。此外，凋亡检测结果可能受到其他细胞死亡形式的干扰，例如坏死或自噬，因此，需要结合多种检测方法进行综合分析。

增殖和生物量检测则用于评估细胞的增殖能力，例如通过检测细胞分裂次数或细胞总数的变化来反映细胞的生长潜力。这类检测方法通常包括基于荧光染料的细胞增殖追踪技术（如CFSE标记）和基于细胞数量的定量检测方法。增殖检测不仅能够评估细胞在特定条件下的生长情况，还能提供关于细胞对药物或其他处理因素的反应信息。然而，增殖检测结果可能受到细胞周期状态的影响，例如细胞处于静止期或活跃增殖期时，检测结果可能呈现不同的趋势，因此，需要结合其他检测方法进行验证。

随着生物技术的不断发展，细胞活力检测方法也在不断演进。近年来，3D细胞培养模型（如多细胞球体和类器官）的兴起为CVAs带来了新的挑战和机遇。3D模型能够更真实地模拟体内微环境，从而提高实验结果的生物学相关性。然而，3D模型的复杂性也增加了检测的难度，例如试剂渗透受限、细胞异质性和成像技术的限制等问题，使得数据解读变得更加复杂。因此，针对3D细胞模型的CVAs需要进一步优化，以提高检测的准确性和可重复性。此外，随着多模态检测技术的发展，研究人员越来越倾向于结合多种检测方法，以获得更全面的细胞活力信息。例如，将代谢活性检测与膜完整性检测相结合，能够更准确地识别细胞死亡的不同阶段，从而避免单一检测方法带来的信息偏差。

在实际应用中，研究人员常常面临选择合适CVAs的难题。一方面，传统的检测方法可能因为其简便性和成本低廉而被广泛使用，但另一方面，这些方法的局限性也可能导致实验结果的不准确。因此，合理选择CVAs不仅需要考虑技术参数，还需要结合实验的具体需求和生物学背景。例如，在药物筛选实验中，研究人员可能需要选择高灵敏度和高通量的检测方法，以快速评估药物对细胞活力的影响；而在基础研究中，可能需要选择能够提供更详细细胞死亡机制信息的检测方法，以支持更深入的生物学分析。此外，实验设计的科学性和数据的可重复性也是选择CVAs时需要考虑的重要因素。

为了帮助研究人员更好地理解和选择CVAs，本文提供了一个可视化的决策树，该决策树结合了机制性洞察和实际应用考虑，能够引导研究人员根据实验目标、细胞类型、检测条件和数据需求等因素，选择最合适的检测方法。该决策树不仅有助于提高实验的准确性，还能增强数据的解释力，减少因检测方法选择不当而导致的误判。此外，本文还强调了在选择CVAs时需要注意的潜在假设和常见干扰因素，例如试剂的稳定性、细胞状态的可变性以及检测条件的控制等，以确保实验结果的可靠性和生物学意义。

总之，细胞活力检测是细胞生物学研究中的重要工具，其选择和应用直接影响实验结果的准确性和可靠性。随着技术的不断进步和实验需求的多样化，CVAs的方法也在不断更新和优化。然而，研究人员在选择CVAs时仍需谨慎，综合考虑实验目标、细胞特性、检测条件和数据需求等因素，以确保检测结果能够真实反映细胞活力的变化。通过合理选择和优化CVAs，研究人员可以更有效地评估细胞健康状况，为生物医学研究、药物开发和生物技术应用提供可靠的数据支持。