先进的表面功能化光纤生物传感平台，用于生物流体中果糖的超灵敏定量检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Advanced surface-functionalized optical fiber biosensing platform for ultrasensitive fructose quantification in biological fluids

本文提出了一种基于级联光纤结构的果糖检测传感器，通过微球腔设计和七芯光纤火焰微调优化结构，获得1735 nm/RIU的高折射率灵敏度。化学固定化KHK酶层实现特异性果糖捕获，检测灵敏度5.98 nm/(μg/mL)，检测限12.6 ng/mL。在血清样本中验证了其抗干扰能力和与LC-MS方法的一致性，Bland-Altman分析显示误差在临床允许范围内，且峰C表现出最佳特异性和灵敏度。该传感器具有快速（5分钟）、低成本、可重复使用的优势，适用于糖尿病等代谢疾病诊断。

　　在医学研究中，对于血液中果糖浓度的评估具有重要的临床意义，因为果糖与多种疾病密切相关。然而，目前的临床技术在实现果糖的快速定量分析方面仍面临诸多挑战。为了应对这一问题，研究团队提出了一种新型的级联光纤传感器，通过单模光纤（SMF）和七芯光纤（SCF）的连续熔接，并利用火焰拉锥技术对七芯光纤进行处理，从而构建出具有高折射率（RI）灵敏度的结构。通过化学固定果糖激酶（KHK）于光纤传感器表面，建立了一个具有靶向结合位点的生物功能层，使得传感器能够对果糖进行特异性检测与定量分析。实验结果表明，该传感器对果糖的标准溶液具有5.98 nm/(μg/mL)的灵敏度和12.6 ng/mL的检测限。在实际应用中，该传感器在人血清样本中表现出良好的特异性与抗干扰能力。此外，通过与液相色谱-三重四极杆质谱（LC-MS）方法的比较，采用Bland-Altman分析，验证了该传感器在临床未知样本中的检测能力和准确性。这种方法具备样本量小、无标记、快速分析和低成本等优势，展现出在临床果糖检测中的巨大潜力。

果糖作为葡萄糖的异构体，广泛存在于日常饮食中，如水果和软饮料。除了饮食摄入外，葡萄糖也可以通过多元醇途径转化为内源性果糖，该过程在糖尿病患者的体内可能显著增强。果糖的代谢速度比葡萄糖快5-10倍，并且与多种代谢性疾病相关。因此，果糖在生物液体中的检测对于多种疾病的诊断和后续监测具有重要意义。血清果糖浓度作为反映身体代谢状态的直接指标，其动态变化与疾病进展之间的关系尚未完全阐明，提示其可能成为代谢性疾病的新生物标志物。目前的研究主要依赖于饮食记录或尿液检测来评估果糖暴露，但这些方法无法准确反映实时代谢状态。相比之下，血清果糖浓度可能更直接地与病理过程相关，如遗传性果糖不耐受（HFI）患者由于醛缩酶B缺乏，果糖代谢受阻，导致血清果糖水平升高；获得性代谢性疾病患者摄入高果糖饮食后，血清果糖水平升高，激活炎症通路并加重胰岛素抵抗；在高血糖条件下，多元醇途径的激活可能导致血清果糖的积累，与糖尿病并发症相关。前瞻性队列研究发现，空腹血清果糖水平的升高与中老年中国人群患2型糖尿病的风险增加独立相关。空腹血清果糖可能成为糖尿病的潜在生物标志物。另一项研究显示，空腹血清果糖水平与糖尿病患者的尿白蛋白水平增加有关，这提示空腹血清果糖可能是糖尿病肾病（DKD）的生物标志物。此外，研究还表明，空腹血清果糖浓度主要代表内源性果糖，且与代谢功能障碍相关脂肪肝病的风险增加有关。通过血清果糖的检测，临床医生可以更好地制定诊断和治疗方案，从而提高患者健康水平。因此，迫切需要开发准确且灵敏的血清果糖浓度检测方法。

当前已有多种生化检测方法用于果糖的检测，包括电化学方法、酶联免疫吸附测定（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）、化学发光和质谱（MS）等。然而，这些方法在某些方面存在局限性。例如，ELISA在对微量分析物进行定量分析时精度较低，而MS虽然精度极高，但其准备和分析过程较为复杂，耗时较长。整体而言，如何实现血清中果糖浓度的快速、无标记、低成本、高灵敏度和高精度检测仍是生物医学领域的一个挑战。近年来，许多光学测量方法被开发用于定量生物分析物，如硅基波导生物传感器、表面增强拉曼散射（SERS）、损耗模式共振（LMR）、表面等离子体共振（SPR）以及太赫兹超材料吸收器等。其中，光纤生物传感器因其小巧、低成本、抗电磁干扰、无标记和高灵敏度等优点，成为研究热点。这类生物传感器通常需要在光纤表面固定生物识别元素或纳米颗粒，以实现对特定分析物的特异性结合，从而有效提高灵敏度。光纤传感器的外部折射率（RI）灵敏度是其基本能力之一，它通过放大由生物结合事件引起的波长或传输强度的变化来实现检测。因此，许多方法如光纤 SPR 或 LMR 传感器、U 型微光纤、倾斜光纤布拉格光栅（TFBG）等被提出以提高 RI 灵敏度并实现理想性能。然而，这些方法往往需要面对机械强度较弱或对制备仪器和表面处理过程有较高要求的问题，无形中提高了制造门槛和成本。相比之下，级联光纤生物传感器同样展现出高 RI 灵敏度，同时具有独特的优点。通过设计光纤器件的内在结构以产生光谱衰减带，通常使用单模光纤作为光传输的输入和输出光纤，将不同类型的光纤部分夹在 SMF 之间形成级联结构，包括多模光纤（MMF）、小芯光纤（SCF）、空芯光纤（HCF）和无包层光纤（CF）。这种配置不仅具有高灵敏度，还具备低成本和易于制造的优势。

鉴于级联光纤生物传感器的优势和果糖检测的日益增长需求，本研究提出了一种新型的级联光纤生物传感器，该传感器采用夹在两个单模光纤之间的微锥形七芯光纤（SCF）。通过在单模光纤和七芯光纤的末端制作微球腔，并将它们熔接在一起，实现了级联结构的构建，该传感器的 RI 灵敏度达到 1735 nm/RIU。为了进行果糖检测，通过化学结合将人类 KHK 固定在光纤表面，使得传感器能够在分析标准样品和生物液体中检测和量化果糖。该传感器表现出高灵敏度（5.98 nm/(μg/mL)）和低检测限（12.6 ng/mL）。在对血清样品中的果糖浓度进行精确量化后，通过液相色谱-三重四极杆质谱（LC-MS）进行光谱检测，结果表明在血清样品中，灵敏度和检测限与标准样品的结果高度一致，这表明该传感器在血清样品中具有良好的特异性与抗干扰能力。此外，该传感器在多次重复使用后表现出可重复性，同时具备稳定的机械性能和可扩展的生产潜力，这表明其在大规模生产中具有良好的应用前景。该生物传感器代表了一种有前景的生物光学系统，有助于推动果糖相关疾病的临床研究，并在高效检测各种生物分子方面展现出巨大潜力。

在材料和试剂部分，所有化学和生物试剂均为分析级，并在使用前未经进一步纯化。实验中使用了多种试剂，包括氯化钠、氢氧化钠、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、牛血清白蛋白（BSA）、戊二醛（GA）和磷酸盐缓冲液（PBS）。此外，还使用了人类 KHK、D-果糖以及兔抗果糖激酶/BF488 联合抗体等。实验过程中，还使用了来自西安交通大学第一附属医院的人血清，以及实验室自制的去离子水（DD water）。

在理论、结构和制备方法部分，传感器的结构示意图显示，通过将两个单模光纤分别连接到超连续光谱光源和光谱分析仪上，七芯光纤被夹在两个单模光纤之间形成级联结构。由于七芯光纤和单模光纤的直径差异，直接对齐其核心进行焊接存在困难，因此通过弧光放电（Fujikura, 100P+）对光纤的两端进行熔接，以形成微球腔。通过调节电机移动距离，实现了七芯光纤的微锥形结构，从而显著增强了级联传感器的 RI 灵敏度。实验中使用了氢氧火焰对七芯光纤进行均匀加热，使其达到软化状态，随后通过两个电机同时以相同距离和速度向相反方向移动，从而实现双向拉伸，避免光纤在锥形化过程中因芯间应力而断裂。系统示意图显示了微锥形七芯光纤的制备过程，以及在不同移动距离下的光谱特性。实验结果显示，当电机移动距离为 0.8 cm 时，传感器表现出最佳的 RI 灵敏度和光谱响应。

在表面修饰和表征部分，为了实现光纤表面的生物功能化，采用了一种逐步的制备过程。首先，通过使用去离子水和无水乙醇对传感器进行彻底清洗，以去除表面污染物。随后，将传感器浸泡在 1.0 M 氢氧化钠溶液中 1 小时，以富集表面的羟基。接着，使用 5% (v/v) 的 APTES 乙醇溶液对传感器进行 3 小时的处理，使 APTES 的硅烷基与表面的羟基发生化学结合，从而有效地将 APTES 固定在表面。APTES 的高反应性极性氨基基团能够与有机生物分子的羧基发生缩合或物理纠缠，从而实现特定有机分子的捕获，形成生物分子膜层。随后，使用 5% (v/v) 的戊二醛（GA）溶液在去离子水中处理 1 小时，GA 分子两端的醛基团能够与 APTES 的暴露极性氨基基团发生交联，使传感器表面能够有效地与 KHK 分子结合。与传统的 EDC/NHS 处理方法相比，这种方法步骤更简单，且不需要对生物分子溶液进行预处理。随后，将传感器浸泡在 10 μg/mL 的 KHK 溶液中 3 小时，实现 KHK 分子在表面的固定，形成生物层。最后，将传感器浸入 5% (w/v) 的 BSA 溶液中，以阻断非特异性结合位点并钝化表面，确保 KHK 与果糖之间的特异性相互作用。值得注意的是，每一步处理后，表面均需用去离子水冲洗并干燥，以去除未结合的单体，防止后续步骤中的聚集效应，确保表面层的均匀性和稳定性。

为了评估 KHK 在光纤表面的固定效果及进一步验证实验结果，采用免疫荧光表征方法。首先，将经过 KHK 和 BSA 处理的光纤浸入稀释 1:100 的兔抗 KHK（在 PBS 缓冲液中）中 4 小时，以促进 BF488 联合抗体与 KHK 生物层的结合。使用荧光显微镜（Nexcope NIB1000）并以 488 nm 激光激发，观察到大约 532 nm 的绿色荧光发射，如图 1e 和 1f 所示。图 1e 显示了微球腔焊接后的结构，而图 1f 则展示了微锥形 SCF 的过渡区域。这些结果表明，兔抗 KHK 能够特异性地识别 KHK，从而验证了使用 KHK 进行果糖浓度检测的可行性。此外，这种方法还能够估计 KHK 在光纤表面的结合量，并通过 KHK 的固定验证生物层的均匀性。

在实验装置部分，实验系统包括上述的超连续光源和光谱分析仪。为了确保测量的准确性，传感器的两端被张紧并固定在光纤夹具上，以减少液体样本检测过程中的拉伸和振动影响。特别设计的顶部插槽 Ω 形沟槽被安装在升降平台上，用于固定传感器并实现光纤在不同溶液中的可控浸入。此外，温度被认为是光纤传感器的交叉敏感参数，可能影响实验的精度。因此，在实验过程中，实验室的环境温度被恒定调节在 23 ± 0.5°C，并且所有准备的分析物样品均经过温度平衡，以确保热一致性，从而消除温度引起的交叉敏感效应。由于温度变化可能导致光纤表面的酶发生变性，因此尽管传感器可重复使用，但建议在室温下测试的时间不超过 3 小时，推荐存储在 4°C 条件下。

对于每个测量，将 1 mL 的分析物溶液引入顶部插槽 Ω 形沟槽中，确保传感器完全浸入。在整个检测过程中，应消除机械变形和环境温度波动的干扰。样品体积和温度的一致性对于可靠的定量分析至关重要。值得注意的是，严格保持每个分析物溶液的体积和温度一致性对于快速定量具有重要意义。这是因为固定在光纤表面的 KHK 酶提供了一定数量的结合位点，而保持一致的温度条件确保了溶质分子的同向运动。在这些受控条件下，可以在固定的时间间隔内准确确定生物结合事件的数量。这种定量关系使得目标分析物的浓度评估更加精确。在每次测量后，进行严格的清洗过程：传感器和顶部插槽 Ω 形沟槽分别用碱性 PBS 缓冲液清洗 3 分钟和去离子水清洗 2 分钟，以去除未结合的单体。清洗和样品注入系统采用三通道配置，其中沟槽的一端连接到 PBS 缓冲液、去离子水和分析物溶液的压力提升装置，而另一端则连接到液体收集系统。该完整的传感系统配置如图 3 所示。

在生物分析物的制备部分，为了验证检测灵敏度和准确性，采用去离子水制备果糖标准样品的梯度浓度系列，范围从 0 到 1000 ng/mL。随后，将每个样品分成两份：一份用于定量检测，另一份则与人血清混合，以模拟复杂基质下的定量检测。值得注意的是，由于溶液在制备后被分装和使用，因此在梯度浓度标准和血清混合样品中，人工添加的果糖浓度是完全相同的。每份血清混合样品均加入相同来源的血清，并使用移液器添加相同体积的血清，以确保样品系列中复杂背景的一致性。此外，由于血清是一种复杂的基质，其含有丰富的营养物质和结合蛋白，因此在评估特异性时，血清是理想的选择。相比之下，血浆则需要抗凝剂，且其背景较为简单，可能无法准确反映生物分子的特异性结合情况。因此，选择血清作为实验材料，能够更准确地评估传感器的特异性。通过将血液样本在至少 10 小时的空腹状态下采集，并在室温下静置 2 小时使血液凝固，随后在 3000 rpm 条件下离心 10 分钟，最终收集血清用于进一步分析。所有实验均遵循相关伦理指南，并经西安交通大学第一附属医院的研究伦理委员会批准。

在血清样品中，血清被均分为六份，每份中加入不同量的果糖标准溶液，同时加入 340 μL 的血清和去离子水，以创建浓度梯度（0 ng/mL，200 ng/mL（5 倍稀释），400 ng/mL（2.5 倍稀释），600 ng/mL（1.66 倍稀释），800 ng/mL（1.25 倍稀释），以及 1000 ng/mL）。所有样品均保持相同的血清背景，以确保实验条件的一致性。

在 LC-MS 测量部分，采用高效液相色谱-三重四极杆质谱（LC-MS，TSQ Quantis，Thermo Fisher Scientific）在多反应监测（MRM）模式下检测制备的血清样品。选择这种方法有两个原因：一是，在传感器相关研究中，通常以梯度浓度或目标特异性样品作为实验协议中的预设参数。然而，实际溶液的制备不可避免地引入人为变化，因此在数据解释之前，必须进行严格的校准过程，以确保获得的结果真实反映传感器的性能特征。二是，由于人血清中的内源性果糖浓度可能引起额外的光谱干扰，因此需要通过 LC-MS 进行检测。实验步骤包括将 50 μL 的血清样品与 200 μL 的有机溶剂（甲醇和乙腈，1:1 v/v）混合，涡旋 2 分钟，随后在 -20°C 条件下孵育 20 分钟，再在 13,000 rpm 条件下离心 15 分钟。收集上清液后，使用 Speed-vac 干燥，并用 100 μL 的 50% 乙腈重新配制，随后进行 LC-MS 分析。通过比较标准曲线和理论值，可以评估传感器的性能。结果显示，传感器在标准溶液中对低浓度样品的检测具有更高的准确性。然而，在复杂背景的血清样品中，低浓度样品的检测值存在较大的误差。此外，通过比较三种峰的性能，发现 Peak C 不仅具有最高的检测灵敏度，而且在复杂样品中对低浓度果糖的检测误差最小，这表明 Peak C 具有更高的检测准确性。这一结果与前述的 ICC 分析结果一致。

为了进一步验证复杂样品中的特异性，进行了三十次测试血清样品（加入 400 ng/mL 果糖）的测量，结果表明 Peak C 的光谱波长波动较小，显示出良好的稳定性。通过统计分析，得到了 0.260 的标准差，这反映了传感器的稳定性，以及固定在光纤表面的 KHK 的时间稳定性和可重复使用性。

在对未知样品的检测性能评估中，研究团队选择了五种来自不同患者的临床血清样品进行果糖浓度的测量。由于稀释后的空白血清样品果糖含量低于 LC-MS 的检测限，无法检测，因此采用了以下实验方案：将每个样品的 500 μL 纯血清稀释至 4 mL，其中 2 mL 用于光谱分析，而剩余的 2 mL 则用于 LC-MS。所有测试方法均与之前描述的实验条件保持一致。使用去离子水的特征波长作为基线，测量五种样品的 Δλ 值，结果如图 7a 所示。通过比较标准校准曲线和由于测试溶液中固有 RI 差异引起的 Δλ 偏移，可以确定五种样品的果糖浓度。这些浓度值通过光谱分析获得，并与 LC-MS 的结果进行比较。图 7b 中的柱状图显示了三种峰的平均浓度值，以及通过标准校准曲线和 LC-MS 测量得到的果糖浓度。结果表明，最大偏差出现在血清样品编号 2 中，对应的误差率为 14.8%。这些结果表明，所述的光纤传感器能够对实际临床样品中未知浓度的果糖进行准确和有效的检测。

在性能分析部分，通过比较不同检测方法的检测限、灵敏度、耗时和选择性，对传感器性能进行了评估。表 2 展示了不同方法在果糖检测中的性能比较。研究显示，基于光纤的生物传感器的检测限与当前领先方法相当，并且能够在临床复杂样品中快速检测目标分析物。此外，表 3 比较了本研究提出的光纤传感器与其他近期报道的光纤传感器研究的性能。通过评估检测限、灵敏度、选择性和检测时间等参数，可以观察到本研究提出的传感器整体性能处于主流水平，其特异性识别和检测能力是其关键优势。这些研究结果表明，该光纤生物传感器在果糖检测中具有良好的应用前景。

总之，本研究开发了一种无标记的级联光纤生物传感器，实现了临床生物液体中果糖的超高灵敏度检测。基于级联传感器结构的灵活性、多样性以及易于制备的优势，提出了通过在单模光纤和七芯光纤上制作微球腔，并进行熔接，从而构建级联波导结构的方法。随后，对七芯光纤进行氢氧火焰加热和熔融，以实现直径可控的锥形化，从而获得具有高 RI 灵敏度的传感器。通过比较不同锥形化参数下的传输光谱和外部环境折射率变化引起的光谱响应，确定了最佳的锥形化参数，并将其用于检测研究。通过化学结合将 KHK 分子固定在光纤传感器表面，形成具有特异性结合位点的生物功能层，使得果糖分子能够特异性地结合到光纤表面，从而改变表面修饰层的有效 RI。这导致了在锥形化七芯光纤表面的渐逝场区域中有效模式 RI 的变化，进而引起光谱干涉峰的波长偏移，并产生与果糖浓度相关的响应。通过梯度浓度果糖标准溶液的光谱测量，获得了三种典型峰的拟合曲线，从而推导出检测限和灵敏度。随后，在人血清样品的复杂背景下评估了传感器对梯度浓度果糖样品的光谱响应。基于 Bland-Altman 分析，比较了传感器在标准溶液和复杂背景下的波长偏移和灵敏度的一致性。由于 LC-MS 被广泛认为是“金标准”，本研究采用其进行梯度浓度果糖样品的绝对定量分析，并评估复杂背景下的空白样品浓度。通过将光纤传感器的定量结果与 LC-MS 的结果进行比较分析，验证了所提出的光纤光谱检测方法在检测精度、特异性、灵敏度和低成本方面的优势。这种快速的血清果糖浓度检测方法不仅对遗传性代谢疾病的诊断至关重要，还为代谢综合征和慢性病的风险评估以及个性化治疗提供了科学依据。此外，该平台还可以通过使用其他天然或合成生物受体扩展到检测其他生物标志物或化学物质，从而支持该技术在临床、环境或工业生产中的未来应用。