yjdF核糖开关非天然调控假说的结构功能挑战：azaaromatic化合物的广谱识别机制再审视

《Nucleic Acids Research》：Structural and functional clues challenge the hypothesis that the yjdF riboswitch is natively regulated through broad recognition of azaaromatic compounds

本研究针对yjdF核糖开关是否通过azaaromatic化合物进行天然调控这一假说展开挑战。研究人员通过解析Bacillus subtilis yjdF核糖开关与激活剂（chelerythrine）和非激活剂（lumichrome）的晶体结构，结合B. subtilis报告基因实验，发现尽管两类化合物结合模式高度相似，但保守的P4a螺旋在调控中起关键作用。结果表明yjdF核糖开关可能响应未知细胞代谢物，仍属于孤儿核糖开关，为理解核糖开关的调控特异性提供了新视角。

　　

在细菌基因调控的精密网络中，核糖开关扮演着分子传感器的关键角色，它们能够直接感知细胞内小分子代谢物的浓度变化，进而调控下游基因的表达。典型的核糖开关由适体域和表达平台组成，前者负责特异性结合配体，后者通过构象变化决定基因的"开启"或"关闭"。目前已知的55多种核糖开关大多表现出极高的配体特异性，能够区分结构相似的代谢物，如赖氨酸核糖开关对丝氨酸的识别能力相差万倍以上。

然而，yjdF核糖开关却是一个引人注目的例外。这种主要存在于厚壁菌门和放线菌门的调控元件，其上游的YjdF蛋白功能尚不明确，更奇特的是，它能够以纳摩尔级的高亲和力结合多种结构各异的氮杂芳香化合物（azaaromatic compounds）。这一现象曾引发一个有趣的假说：yjdF核糖开关可能通过广谱识别毒性azaaromatic化合物，激活YjdF蛋白的表达来执行解毒功能，类似于细菌中的PadR调控蛋白。

但这一假说存在明显矛盾：虽然许多azaaromatic化合物都能结合yjdF核糖开关，但只有少数能够真正激活基因表达。例如，chelerythrine和sanguinarine结构相似且结合亲和力相当，前者能激活翻译而后者不能。这种结合与调控活性的脱节现象，促使科罗拉多大学的研究团队对yjdF核糖开关的调控机制进行深入探索。

研究人员主要运用了X射线晶体学解析RNA-配体复合物结构、荧光结合测定分析配体亲和力、系统发育分析保守序列元件以及Bacillus subtilis报告基因系统评估体内调控活性等技术方法。通过比较激活剂和非激活剂结合状态下的结构差异，结合定点突变功能验证，揭示了yjdF核糖开关独特的识别机制。

结晶B. subtilis azaaromatic (yjdF) 核糖开关适体域

研究人员通过系统发育分析507条yjdF序列，确定了可用于结晶的RNA工程策略。他们将L3和L4环替换为GAAA四环，调整P1、P3和P4螺旋长度，获得了与lumichrome和chelerythrine复合的晶体结构，分辨率达2.55 ?。突变结合实验证实这些修饰不影响配体结合，而保守的L2环替换则使亲和力降低超过10000倍，凸显了L2在配体识别中的关键作用。

yjdF核糖开关的整体结构由两组共轴堆叠螺旋定义

晶体结构揭示yjdF核糖开关采用T形结构，由两个主要螺旋轴组成：一个包含芳香配体结合口袋（P1-P2-P3），另一个延伸至包含反RBS序列的调控螺旋P4/L4。两个螺旋轴近乎垂直排列，通过结构化连接区和非经典碱基配对网络稳定。结构分析发现了未预测的P3b、P4a螺旋和两个假结（PK1、PK2），这些元件在系统发育中高度保守。

P2-P3共轴堆栈承载芳香结合口袋

配体结合位点嵌入P2-P3共轴堆栈中，P1螺旋通过J1/2区的三个腺苷（A7、A8、A9）与P2-P3堆栈锚定。L2环形成类似T环的结构 motif，与tRNA^Asp的T环具有高度结构相似性。配体结合口袋由A10-U26 Hoogsteen/WCF碱基对和U22·A27-U49碱基三重体定义，形成一个开放的大平面结合界面，可容纳不同大小和形状的芳香化合物。

Lumichrome和chelerythrine与T环样结构元件相互作用

L2环的扩展T环 motif为配体结合提供关键位点。Lumichrome插入U26和A27之间，与A10的2'-羟基形成单一氢键；而chelerythrine占据相似位置但不形成氢键，其正电荷可能通过π-阳离子相互作用增强结合。两者结合模式的相似性无法解释其调控活性差异。

yjdF适体域结合并增强荧光染料的荧光

研究人员发现yjdF适体域能够结合多种荧光染料，如thiazole orange（K_D=0.24±0.06 nM）和chelerythrine（K_D=0.43±0.02 nM），并显著增强其荧光。带正电荷的染料普遍显示更高亲和力，这一特性暗示yjdF适体域有潜力开发为新型RNA成像工具。

P3b-P4a-P4共轴堆栈连接配体结合位点与反RBS序列

P3b-P4a-P4堆栈通过未预测的碱基相互作用将L2配体结合位点与L4调控区连接。P4a螺旋包含两个非经典嘧啶-嘧啶错配（C52·U71和U54·U69）和一个WCF C53-G70对，这些高度保守的元件在配体诱导的构象变化中起关键作用。稳定P4a的突变（如U54A）增强组成型基因表达，而不影响配体结合，支持P4a作为调控转换器的功能。

P4a对调控活性至关重要但暗示yjdF可能仍是孤儿核糖开关

B. subtilis报告基因实验证实chelerythrine能激活lacZ表达，而lumichrome即使在50μM浓度下仅微弱激活。稳定P4a的突变（U54A、C52G）在无配体情况下增强表达，而破坏P4a的突变（G70C）消除调控活性。然而，违背系统发育保守性的P4a碱基对转换突变仍保持chelerythrine依赖性激活，这与间接通信模型矛盾。

研究结论与讨论部分指出，yjdF核糖开关的配体结合口袋结构与功能分析明确解释了其对芳香化合物的广谱识别能力，但无法合理解释为何仅有部分结合化合物能激活翻译。激活剂和非激活剂的结合模式高度相似，配体在结合口袋中的取向缺乏特异性，以及P4a元件的系统发育保守性与突变分析结果之间的矛盾，都挑战了azaaromatic化合物作为天然效应物的假说。

研究人员提出，yjdF核糖开关的真正效应物可能是一种同时包含芳香和非芳香基团的内源性代谢物，能够直接接触P4a螺旋的高度保守核苷酸（C52、C53/G70、U71），实现特异性调控。这种双向识别模式类似于FMN（flavin mononucleotide）核糖开关，其中芳香环和磷酸基团分别被RNA特异识别。因此，yjdF核糖开关可能仍属于孤儿核糖开关，其生物学相关效应物尚待发现，这与已知核糖开关通常响应单一或密切相关的代谢物的特性一致。

这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究不仅深化了对核糖开关调控机制的理解，也为开发基于RNA的分子传感器和成像工具提供了新思路。yjdF适体域对多种荧光染料的高亲和力结合特性，尤其为活细胞RNA成像技术的创新提供了潜在价值。