LNA-磷酸硫代三酯键增强反义寡核苷酸性能：新型剪接转换寡核苷酸的生物物理与生物学特性研究

《Nucleic Acids Research》：Biophysical and biological properties of splice-switching oligonucleotides and click conjugates containing LNA-phosphothiotriester linkages

本研究针对反义寡核苷酸(ASO)生物利用度低和毒性大的问题，开发了含LNA-磷酸硫代三酯(PTTE)骨架的新型剪接转换寡核苷酸(SSO)。通过系统合成60余种含烷基/炔基PTTE的寡核苷酸及其点击缀合物，发现其均能保持优异的DNA/RNA双链稳定性，并在体外剪接转换实验中显示良好活性。氨基酸缀合物通过gymnosis途径展现显著高于糖类缀合物的活性，为优化治疗性寡核苷酸提供了新策略。

　　

在精准医疗时代，反义寡核苷酸(ASO)作为革命性疗法为遗传疾病治疗带来曙光，例如用于脊髓性肌萎缩症(SMA)的诺西那生(nusinersen)和用于杜氏肌营养不良症(DMD)的依特普森(eteplirsen)。然而这些疗法面临两大瓶颈：一是生物利用度低，需要高剂量给药；二是磷酸硫代(PS)修饰带来的毒性问题。传统PS骨架虽能增强核酸酶抗性，但会降低RNA靶标结合亲和力，且与蛋白质的非特异性结合可能导致毒副作用。

为解决这一难题，牛津大学化学系Debashis Dhara与Tom Brown团队将目光投向电荷中性骨架。与带负电的PS骨架不同，电荷中性骨架如磷酰二胺 morpholino(PMO)已成功用于DMD治疗，但其合成路线复杂限制了广泛应用。研究团队前期开发了锁定核酸(LNA)-烷基磷酸硫代三酯(PTTE)骨架的简易合成方法，这种新型骨架不仅具备电荷中性特点，还能通过灵活的点击化学进行功能化修饰。

本研究系统评价了多种LNA-PTTE修饰寡核苷酸的生物物理和生物学特性。研究人员设计了包含2-丁基、2-己基、3-辛基、4-三氟甲基环己基、十六烷基等多种烷基侧链的PTTE骨架，并通过铜催化的叠氮-炔环加成反应(CuAAC)将碳水化合物、氨基酸、七乙烯二醇、精胺和噻唑橙等功能分子引入寡核苷酸内部位点。

关键技术方法包括：采用固相磷酰胺化学法合成PTTE寡核苷酸，通过CuAAC点击反应进行后合成修饰，利用紫外熔解实验和圆二色谱分析双链稳定性，使用HeLa pLuc/705报告细胞系评估剪接转换活性。所有实验均设2'-O-甲基PS(2'OMePS)阳性对照和LNA-PS对照进行比较。

寡核苷酸合成

研究成功合成了超过60种修饰寡核苷酸，其中烷基LNA PTTE寡核苷酸包含1-3个不同烷基侧链的PTTE修饰。特别值得关注的是，团队开发了含4-戊炔基和5-己炔基LNA-T-PTTE键的寡核苷酸，为后续点击化学修饰奠定基础。合成过程中，5-己炔醇在去保护步骤中易发生部分裂解，而戊炔基衍生物则表现优异稳定性。

点击反应在20-150纳摩尔规模进行，多数反应产率高达88%以上。七乙烯二醇多次添加时产率约60%，噻唑橙(TO)叠氮化物产率为45%-71%，而精胺多次添加挑战最大，两个精胺添加产率为42%，三个精胺的纯品未能获得。

双链稳定性

熔解温度(T_m)测定显示，除C16-脂质和TO T2外，所有修饰均能稳定与DNA/RNA的双链结构，ΔT_m相对2'OMePS+对照提高1.5-15.6°C(DNA)和1.4-17.0°C(RNA)。2-丁基修饰表现最佳，四个插入时对DNA和RNA的T_m分别达61.6°C和74.3°C。双精胺缀合(Sper T2)使双链稳定性大幅提升(ΔT_m RNA +13.3°C)，而C16-脂质多插入显著 destabilizing。

双链构象

圆二色谱分析表明，修饰寡核苷酸与DNA形成的双链保持典型B型螺旋结构，与RNA则形成A型螺旋结构。含四个LNA己基和辛基三酯桥的寡核苷酸出现轻微构象扰动，氟化三酯在260-280 nm处椭圆度降低。

荧光特性

噻唑橙(TO)标记的寡核苷酸在单链状态下荧光微弱，与互补DNA/RNA结合后荧光显著增强，表明TO与核酸双链发生 groove binding 或 intercalation。TO A2衍生物荧光增强最明显，说明其结构差异影响荧光特性。

生物学研究

在HeLa pLuc/705细胞系中评估剪接转换活性时发现，在脂质体转染条件下，MOP和iPr PTTE修饰显著提升活性，C16单插入改善活性但多插入反而损害。在gymnosis(无转染试剂)条件下，小尺寸烷基(如丁基)修饰增强活性，而大尺寸烷基(如辛基)多插入抑制活性。氨基酸缀合物(尤其是苯丙氨酸)表现优异，碳水化合物缀合物活性相对较低。

研究团队通过系统分析T_m与剪接转换活性的关系，发现部分修饰同时改善T_m和活性(绿色区域)，部分改善T_m但降低活性(橙色区域)，C16则同时降低两者(红色区域)。值得注意的是，未发现降低T_m但提升活性的修饰类型。

本研究开创性地建立了LNA-PTTE寡核苷酸的简易、可扩展合成平台，实现了多种功能分子在寡核苷酸内部位点的精准修饰。虽然目前尚无含LNA的寡核苷酸药物获批，但将LNA与磷酸三酯/磷酸硫代三酯结合可能改善其毒理学特性。该策略为优化治疗性寡核苷酸提供了新思路，未来可扩展至RNase H活性ASO、siRNA、miRNA和anti-MiR等更多寡核苷酸 therapeutics 领域。

研究证实，通过合理设计PTTE侧链，可在保持RNA靶标结合亲和力的同时，优化寡核苷酸的细胞摄取和细胞内 trafficking特性。特别是氨基酸缀合物展现的优异性能，为开发高效低毒的寡核苷酸药物指明了新方向。这种模块化合成方法为寡核苷酸药物的"精准设计"提供了强大工具，有望推动核酸药物治疗领域的创新发展。