Docsubty：来自Bacillus velezensis LPL061的角质酶候选基因在Escherichia coli BL21(DE3)中的过表达

《Environmental Toxicology and Pharmacology》：Docsubty: FLAOverexpression of Keratinase Candidate from Bacillus velezensis LPL061 in Escherichia coli BL21(DE3)

枯草芽孢杆菌LPL061来源的角质酶KerFull在E. coli BL21(DE3)中表达，通过SDS-PAGE和QTOF-MS验证其结构。KerFull含I9前导肽，分子量28.5 kDa，具宽pH（6-11）和温度（37-70℃）稳定性，鸡毛羽蛋白降解活性达16.67-34.14 U/mg，I9域对酶活性和折叠至关重要，适合工业应用。

　　

Desi Sagita|Tirza Jeli Ping|Aluicia Anita Artarini|Rachmat Mauluddin|Edwin Setiawan|Anto Budiharjo|Catur Riani

药物生物技术实验室，药学系，万隆理工学院，Jl. Ganesa 10，万隆，西爪哇省，印度尼西亚，40132

摘要

蛋白酶在工业上有广泛的应用，其中包括角蛋白酶，它可以降解富含角蛋白的基质，如头发、指甲、羽毛和皮肤。本研究旨在将Bacillus velezensis LPL061（WP_003155195.1）中的蛋白酶在Escherichia coli BL21(DE3)中表达，并评估其角质蛋白分解能力，以作为新的角蛋白酶来源。设计了两个基因构建体，一个包含前肽结构域（kerfull），另一个不包含（kerhalf）。在20°C下，使用0.05 mM IPTG诱导表达20小时。KerFull通过连续超滤部分纯化。SDS-PAGE分析显示，KerHalf是一种32.2 kDa的蛋白质，而KerFull则表现为38 kDa的融合蛋白和28.5 kDa的成熟蛋白。QTOF-MS确认了其氨基酸序列。只有KerFull表现出蛋白水解和角质蛋白分解活性，这突显了I9结构域对正确折叠和酶激活的重要性。尽管产量较低，部分纯化的成熟KerFull蛋白（P50组分）仍保留了活性。KerFull在pH 6-11范围内具有广泛的稳定性，最佳pH值为9，并且在37-70℃的宽温度范围内保持活性，最佳温度为60℃。该蛋白在20–40℃和pH 8时也保持稳定。粗蛋白中的比活性达到16.67 U/mg，P50组分中的比活性为34.14 U/mg。当与DTT结合时，KerFull在37℃下4小时内能有效降解鸡羽毛的羽枝。这些发现表明，B. velezensis LPL061（WP_003155195.1）中的某种蛋白酶是一种性能优良的角蛋白酶候选者，具有宽泛的操作pH和温度范围，即使在低浓度下也能高效降解角蛋白，使其成为工业应用中的有前景的候选者。

章节摘录

引言

蛋白酶是一类能够催化肽键水解的酶，在消化、蛋白质周转和其他生物过程中起着重要作用。由于其广泛的催化能力，蛋白酶被应用于多个工业领域，包括食品、纺织、洗涤剂和制药行业。蛋白酶在制药领域的一个重要应用是它们能够降解角蛋白，这是一种存在于头发、指甲和皮肤外层的坚韧且不溶的蛋白质。

细菌菌株、质粒和培养基

B. velezensis的基因组DNA保存在印度尼西亚三宝垄迪波内戈罗大学的生物技术系，并作为淡水海绵Eunapius carteri的共生菌被分离出来。B. velezensis在营养肉汤中于37℃下培养。用于克隆的细菌是E. coli TOP10，用于基因表达的细菌是E. coli BL21(DE3)。用于克隆的质粒是pTArget Clone（Toyobo），用于表达的质粒是pET16b（Novagen）。E. coli在Luria Bertani（LB）培养基中于37℃下生长。

角蛋白酶编码基因的克隆

在我们之前的研究中，我们使用简并引物成功分离并表征了B. amyloliquefaciens的subtilisin DFE（AAZ66858.1），该蛋白具有纤维蛋白溶解活性[9]。这种蛋白与B. velezensis LPL061中的17种已注释的丝氨酸蛋白酶之一WP_003155195.1具有98.69%的氨基酸序列相似性。Subtilisin DFE和角蛋白酶都属于丝氨酸蛋白酶家族。B. licheniformis的subtilisin Carlsberg能够降解角蛋白[20]。有趣的是

讨论

多项研究报道了B. velezensis的细胞外蛋白具有角质蛋白分解活性[12]、[23]、[24]、[25]。已报道的B. velezensis角蛋白酶的分子量有多种，包括39 [11]；40-55 [25]；100；62.5；36.5；以及25 kDa [24]。从B. velezensis菌株MAMA和B. velezensis NCIM 5802中分离出的蛋白酶具有角质蛋白分解活性，但具体的蛋白酶序列尚未报道[25]。只有少数研究报道了B. velezensis的蛋白酶序列

结论

KerFull（WP_003155195.1）是B. velezensis LPL061中的一种蛋白酶，已被证实具有角质蛋白分解活性。I9抑制结构域的存在对其正确折叠和功能至关重要。通过在20°C下使用0.05 mM IPTG诱导20小时培养，在E. coli BL21(DE3)中产生了可溶且活性的重组KerFull，其分子量为28.5 kDa。这种部分纯化的酶可以降解酪蛋白、头发和鸡羽毛中的角蛋白。该酶在37-70℃下能够降解角蛋白。

资金来源

本研究得到了印度尼西亚财政部提供的博士论文奖学金（BPI Scholarship）以及印度尼西亚合作研究计划（PPKI）PTNBH 2020和2021年的资助，项目编号分别为069/I1.B04.1/SPP-LPPM/III/2020；042/IT1.B07.1/SPP-LPPM/II/2021；952/PKS/ITS/2020和193.03/UN7.6.1/PP20。

作者贡献声明

Edwin Setiawan：撰写 – 审稿与编辑、资源获取。Anto Budiharjo：撰写 – 审稿与编辑、资源获取。Aluicia Anita Artarini：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、数据分析、概念化。Rachmat Mauluddin：撰写 – 审稿与编辑、监督。Desi Sagita：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、方法学设计、实验设计、资金获取、数据分析。

致谢

作者衷心感谢教育部高等教育基金、万隆理工学院的研究与社区服务局（DRPM）以及Hilmi Ramadhan在QTOF质谱分析准备方面的技术协助。

免责声明

无

利益冲突披露

无