开发并优化了一种用于硝基色氨酸生物合成的工程化大肠杆菌平台

《Environmental Toxicology and Pharmacology》：Development and optimization of an engineered E. coli platform for nitrotryptophan biosynthesis

高效生物催化硝基色氨酸合成体系的构建与优化。采用融合蛋白TB14（TxtE-linker14-BM3R）和 BsNOS 或 SNP 生成 NO，在 E. coli 中实现 L-色氨酸直接硝化。通过代谢工程优化（途径平衡、发酵条件改进、竞争途径抑制），48 小时内产量达 209.9 mg/L，建立微生物合成硝基芳香化合物的可靠平台。

　　这项研究聚焦于利用合成生物学手段，在大肠杆菌中构建一种高效的生物催化反应系统，以实现硝基色氨酸（nitrotryptophan）及其异构体的合成。硝基化合物，尤其是硝基芳香族和杂环衍生物，在工业中具有重要的应用价值，广泛用于食品防腐剂、农业化学品、杀虫剂、除草剂、塑料、炸药以及染料等领域。此外，硝基化合物在制药工业中也扮演着关键角色，例如在治疗帕金森病、心脏病、癌症和传染病的药物中都有应用。然而，传统的化学硝化方法往往伴随着低选择性、高污染和安全风险等问题，这促使科学家们探索更为环保和高效的生物催化策略。

本研究通过引入一种来自链霉菌的自给型细胞色素P450酶（TB14，由TxtE-连接子14-BM3R组成），成功实现了对L-色氨酸（L-Trp）吲哚环的直接硝化。这一过程依赖于硝酸氧化酶（BsNOS）或其化学替代物亚硝酸钠（SNP）来催化L-精氨酸转化为硝酸（NO），从而提供必要的硝化试剂。由于细胞色素P450酶和硝酸氧化酶均需要NADPH作为还原剂，研究团队进一步引入了来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶（GDH），以确保系统内NADPH的持续再生，维持反应的高效进行。

在实验设计中，研究者首先构建了一种工程化菌株，该菌株在TB培养基中能够生产133.2 mg/L的硝基色氨酸。随后，通过系统性的优化策略，包括代谢通路的平衡、发酵条件的改进以及消除竞争性代谢途径，最终在48小时内将产量提升至209.9 mg/L。这一成果不仅证明了该生物催化系统的可行性，也为微生物合成有价值的硝基芳香族化合物提供了坚实的基础。同时，研究还揭示了构建高效生物催化系统的关键要素，为未来的生物硝化策略提供了重要的理论支持和技术参考。

在研究过程中，L-色氨酸作为关键的芳香族氨基酸，对人类和动物都具有重要的生理意义。它不仅是蛋白质合成的重要组成部分，还参与多种生物化学反应，如神经递质的合成和免疫调节。因此，能够高效地合成硝基色氨酸，不仅有助于拓展其在工业和医药领域的应用，还可能为相关生物过程的研究提供新的思路。

为了实现硝基色氨酸的合成，研究团队设计了一种包含多个功能模块的生物合成路径。其中，P450酶TxtE因其独特的催化能力而受到关注，能够直接在L-色氨酸的吲哚环上引入硝基。然而，TxtE作为一种I类P450酶，其催化活性受到外部还原系统的限制。为此，研究者通过构建融合蛋白（如TxtE-连接子14-BM3R），实现了酶活性的增强，提高了硝化反应的效率。这种融合蛋白的设计借鉴了自然界中自给型P450 BM3R的结构，通过连接子的调控，使得酶之间的电子传递更加高效，从而克服了传统P450酶在工业应用中的瓶颈。

在硝酸的生成方面，研究团队采用了两种不同的策略：一种是利用BsNOS酶催化L-精氨酸生成NO，另一种是通过添加外源性化学试剂SNP来提供NO。这两种方法都能够在实验条件下有效支持硝化反应的进行。其中，SNP驱动的系统因其操作简便、成本低廉而受到青睐，而BsNOS则为生物催化系统提供了更环保的替代方案。通过比较这两种方法的效率和适用性，研究者为实际应用提供了更加灵活的选择。

此外，研究还关注了L-色氨酸在大肠杆菌中的生物合成路径。L-色氨酸的合成涉及多个关键步骤，包括磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）的缩合反应，生成3-脱氧-D-阿拉伯糖酮酸-7-磷酸（DAHP），这是L-色氨酸合成的重要中间体。随后，DAHP经过一系列酶促反应，最终转化为L-色氨酸。这一合成过程受到多种调控机制的影响，如转录抑制、衰减调控和反馈抑制。其中，色氨酸衰减系统因其对体内L-色氨酸浓度的敏感性而成为调控的关键环节。因此，研究团队提出了通过消除或失活色氨酸衰减系统来提高L-色氨酸积累的假设，并在实验中验证了这一策略的有效性。

研究团队还通过整合多种代谢工程手段，优化了整个生物合成系统的性能。例如，通过调整基因表达水平、增强关键酶的活性以及优化培养条件，研究人员成功提高了硝基色氨酸的产量。这些优化措施不仅提高了生产效率，还降低了生产成本，使得该系统具备了实际应用的潜力。在实验过程中，研究者还对不同连接子长度的融合蛋白进行了系统性评估，发现连接子14的融合蛋白（TB14）在催化活性方面表现尤为突出，相较于单独的TxtE酶具有显著的提升。

本研究的成果具有重要的科学和工业意义。首先，它为微生物合成硝基芳香族化合物提供了一种新的方法，避免了传统化学硝化过程中产生的环境污染问题。其次，该系统能够实现对L-色氨酸的高效转化，为相关药物和功能材料的生产提供了可行的生物途径。此外，研究还展示了如何通过蛋白质工程和代谢调控相结合的方式，构建一个高效、稳定且可扩展的生物催化平台。这一平台不仅可以用于硝基色氨酸的合成，还可以为其他硝基化合物的生物合成提供借鉴。

在实际应用方面，该研究的成果有望推动绿色化学和可持续生物制造的发展。传统的硝化反应通常需要强酸作为催化剂，这不仅对环境造成污染，还可能对操作人员带来安全隐患。相比之下，生物催化系统利用酶促反应进行硝化，具有更高的选择性和更低的副产物生成，因此更加环保和安全。同时，该系统能够通过调整培养条件和基因表达水平，实现对产物的精准调控，为工业生产提供了更大的灵活性。

从科学角度来看，本研究的突破在于成功构建了一个自给型的生物催化系统，使得P450酶和硝酸氧化酶能够在同一个细胞内协同工作，而无需依赖外部的还原系统。这种系统的设计不仅提高了反应效率，还降低了生产成本，为未来的生物催化研究提供了新的方向。此外，研究团队通过系统的实验验证，展示了如何通过代谢工程手段优化整个合成路径，从而实现更高的产量和更优的产物质量。

综上所述，这项研究通过整合先进的蛋白质工程技术和代谢调控策略，成功构建了一个高效的生物催化系统，实现了对硝基色氨酸的直接合成。这一成果不仅拓展了生物催化在有机合成中的应用范围，还为绿色化学和可持续生物制造提供了重要的技术支持。未来，随着相关技术的进一步发展，该系统有望在更多领域得到应用，推动生物制造技术向更高效、更环保的方向迈进。