基于突变研究的具有高活性的O-甲基转移酶的鉴定，该酶可用于表没食子儿茶素没食子酸酯的区域选择性甲基化

《Environmental Toxicology and Pharmacology》：Mutational study-based identification of high activity O-methyltransferase for the regioselective methylation of epigallocatechin gallate

甲基化酶定向进化增强EGCG生物利用度及活性研究。通过分析Bacillus licheniformis Bl_OMT的活性位点，F163W突变体活性提升2倍，同时通过序列比对筛选出Thermolongibacillus altinseunsis和Bacillus subtilis的OMT具有更高催化效率（kcat/Km分别为17.4和11.3 M?1s?1，野生型8.7 M?1s?1），揭示芳香族氨基酸对底物结合的关键作用

　　

京国公园|金秉基|徐周贤

首尔国立大学生物工程跨学科项目，韩国首尔08826

摘要

(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯（EGCG）的位点特异性甲基化，尤其是D环上的3位羟基，显著增强了其在人体内的稳定性和生物利用度。因此，甲基化是使EGCG更具口服活性和更强效营养保健品的方法。在本研究中，为了有效合成甲基化EGCG，我们研究了依赖S-腺苷-L-蛋氨酸的O-甲基转移酶（OMT）来合成甲基化EGCG。已知来自Bacillus licheniformis和B. megaterium的OMT具有EGCG的甲基化活性。由于Bacillus licheniformis的OMT（Bl_OMT）在两种OMT中表现出更高的活性和区域选择性，我们尝试使用Bl_OMT进行合理设计。Bl_OMT的F163W突变体在EGCG甲基化方面的初始速度比野生型Bl_OMT提高了2倍。这一工程结果进一步用于从序列数据库中鉴定高活性OMT。通过BLAST收集了100个Bacillus licheniformis的OMT同源序列和100个B. megaterium的OMT同源序列。对202个序列进行多重比对以生成亚组，并进一步研究了每个亚组中的4个代表性序列。结果表明，来自Thermolongibacillus altinseunsis和B. subtilis的OMT与Bl_OMT属于同一同源组，其活性更高，同时保持了相同的高区域选择性。Thermolongibacillus altinseunsis和B. subtilis的OMT的kcat/Km值分别为17.4 M^-1 s^-1和11.3 M^-1 s^-1，而Bl_OMT的kcat/Km值为8.7 M^-1 s^-1。因此，我们发现OMT活性位点的苯丙氨酸残基对于底物疏水部分的紧密结合非常重要，将其突变为色氨酸可以增强结合强度。

引言

(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯（EGCG）是茶叶儿茶素的主要多酚成分，也是其主要活性成分，具有多种生理和治疗效果，包括抗炎和抗过敏[1]、[2]、抗菌和抗病毒[3]、[4]、抗衰老[5]以及预防心血管疾病[6]。最近，有研究报道EGCG对SARS-CoV-2病毒引起的肺纤维化具有抗纤维化作用[7]。EGCG在缓解肺纤维化方面的疗效使其在营养保健品市场上更具吸引力。然而，EGCG在血液和肠道中非常不稳定，容易自氧化并被肠道微生物群降解。由于这些缺点，EGCG通过口服给药时的生物利用度较低[8]。为了提高EGCG的药代动力学，甲基化可以改变其理化性质。特别是EGCG D环的甲基化，其产物(-)-表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基)-没食子酸酯（3MeEGCG）的生物利用度可提高2.7倍[9]。此外，3MeEGCG作为药物对高血压和牙周炎具有更强的治疗效果[6]、[10]。

尽管3MeEGCG的生物利用度得到了提高，但在茶提取物中的含量很少（低于1%（w/w）[11]。获得3MeEGCG的替代方法包括化学合成和酶促合成。其中，化学合成需要包括保护和脱保护在内的复杂步骤[12]。因此，尽管使用了S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM），酶促合成仍具有明显优势。在之前的研究中，已报道几种O-甲基转移酶（OMT），包括从Camellia sinensis（茶叶）或Flammulina velutipes（可食用蘑菇）中分离出的OMT，具有对EGCG的O-甲基化活性[13]、[14]。然而，这些酶缺乏区域选择性，从而降低了酶促O-甲基化反应的产率并产生了许多副产物。随后，从Bacillus licheniformis和B. megaterium中发现了两种OMT[15]。根据Nho（2020）的研究，Bacillus licheniformis的OMT（Bl_OMT）的O-甲基化产物生成量与SAM浓度成正比，而Bacillus megaterium的OMT（Bm_OMT）在SAM浓度较高时会产生更多副产物。换句话说，虽然Bm_OMT的O-甲基化活性较低，但它表现出区域选择性。

基于这项研究，我们尝试创建一个具有相同区域选择性的更活性Bl_OMT突变体。我们采用了基于活性位点分析的合理设计方法，而不是随机突变，因为需要保持高区域选择性。我们还通过序列聚类、蛋白质-配体对接模拟等方法来鉴定更有效的EGCG甲基化OMT。

章节片段

材料

EGCG和SAM-HCl购自Sigma-Aldrich Korea（韩国首尔）。乙酸乙酯购自Junsei（日本东京）。LB培养基来自DIFCO Laboratories（美国新泽西州富兰克林湖）。寡聚物购自Bionics（韩国首尔）。核苷酸测序由Macrogene（韩国首尔）完成。限制性内切酶和T4 DNA连接酶分别来自Thermo Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和Takara（日本滋贺）。

OMT的序列比对、蛋白质结构预测和蛋白质-配体对接模拟

Bl_OMT的同源序列

结果与讨论

“结果与讨论”部分中的残基编号是指Bl_OMT的残基编号。其他OMT中相应的残基可以在图2和图4中的比对结果中找到。

结论

我们确认OMT的插入环，特别是第163位和第164位残基，对EGCG甲基化反应的活性和区域选择性有影响。将残基突变为芳香族氨基酸可以增强甲基化活性，同时保持区域选择性。尽管工程改造成功，我们仍希望通过鉴定同源序列集的代表序列或中心序列来寻找更有效的OMT。

CRediT作者贡献声明

金秉基：撰写——初稿、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。京国公园：撰写——初稿、方法学、实验研究、数据分析、数据管理、概念构思。徐周贤：审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、监督、方法学、实验研究、数据管理、概念构思。

作者同意声明

该手稿尚未被任何作者发表，且在提交时也未考虑在其他期刊上发表。所有作者同意将当前版本的手稿提交给《Enzyme and Microbial Technology》。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划的支持，该计划由教育部资助（RS-2023-00252589）。本研究还得到了韩国环境产业技术研究院（KEITI）生物材料专业研究生项目的支持，该项目由环境部（MOE）资助。