《Fish & Shellfish Immunology》：Modulatory role of tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain protein (TRADD) in innate antiviral immune responses and apoptosis in red-spotted grouper (
Epinephelus akaara)
编辑推荐：
红鲈鱼TRADD同源蛋白（EaTRADD）结构及功能研究表明其广泛表达于各组织，在脾脏和血液中免疫刺激后显著上调。细胞实验证实EaTRADD过表达可抑制病毒复制并激活干扰素相关基因及NF-κB信号通路，同时促进凋亡酶caspase-3/8/9活性，提示其在抗病毒免疫和程序性细胞死亡中起关键调控作用。
E.M.T. Tharanga|Jihun Lee|J.D.H.E. Jayasinghe|Jeganathan Tharshan Jeyakanesh|R.I. Sandeepani|W.P.S.N. Wijeweera|D.M.K.P Sirisena|Qiang Wan|Seongdo Lee|Jehee Lee
韩国济州国立大学海洋生命科学系与基因组选择中心，济州63243，大韩民国
摘要
肿瘤坏死因子受体1相关死亡结构域蛋白（TRADD）是一种独特的适配分子，参与多种受体介导的信号通路，这些通路以依赖环境的方式调节细胞存活和凋亡。尽管对哺乳动物中的TRADD进行了大量研究，但其在硬骨鱼类中的功能作用仍不甚明了。为填补这一空白，本研究对红点石斑鱼（Epinephelus akaara，EaTRADD）的TRADD同源物进行了表征，以确定其在硬骨鱼类中的功能。预测的EaTRADD编码一个由291个氨基酸组成的蛋白质，包含一个N端结构域和一个C端死亡结构域。结构分析证实，EaTRADD在不同生物体中具有保守的结构域特征。在正常生理条件下进行的空间表达分析显示，EaTRADD在所有检测组织中普遍表达，其中脾脏中的表达水平最高。免疫刺激后，EaTRADD在脾脏和血液中的表达显著上调。亚细胞定位分析表明，EaTRADD主要定位于细胞质中。在脂头鲦鱼细胞中过表达EaTRADD显著抑制了病毒复制，并伴随干扰素相关基因和促炎细胞因子的转录增加，这为其抗病毒特性提供了有力证据。此外，双荧光素酶报告基因实验表明，EaTRADD在病毒感染后激活NF-κB信号通路。进一步地，EaTRADD过表达在基础条件下以及氧化应激条件下显著增加了凋亡活性，同时激活了caspase-3、-8和-9。总体而言，我们的研究结果表明，EaTRADD是红点石斑鱼先天抗病毒免疫反应和凋亡的关键调节因子。
引言
肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体超家族（TNFSF/TNFRSF）调节多种重要的生物过程，包括细胞死亡、细胞增殖和免疫反应[1]。死亡受体（DRs）因其死亡结构域（DD）而具有关键作用，负责在该超家族内传递凋亡和免疫调节信号[2]。具有DD的TNFRSF成员包括肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）、FAS（CD95）、TRAILR1（DR4）和TRAILR2（DR5）。这些DRs通过与含有DD的适配蛋白相互作用来启动信号转导级联反应，例如TNFR1相关死亡结构域蛋白（TRADD）、Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）和受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）[3]、[4]。
TRADD由TRADD基因编码，是一种独特的适配蛋白，在介导细胞对各种应激反应的响应中起关键作用，包括免疫防御和程序性细胞死亡[5]、[6]。TRADD最初在哺乳动物系统中被发现，参与多种生理过程，如炎症、凋亡和免疫反应。TRADD主要通过其与肿瘤坏死因子受体（TNFR）通路的结合来介导信号传导，这些通路依赖于两个不同的结构域：N端结构域（NTD）和C端死亡结构域（CTD）[7]、[8]。TRADD的N端与肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）相互作用，促进细胞凋亡抑制蛋白1/2（cIAP1/2）的招募。这种相互作用导致IκB激酶（IKK）的激活，进而磷酸化IκBα，触发核因子κB（NF-κB）信号通路并促进细胞存活[9]、[10]。相反，TRADD的DD与FADD相互作用，招募促caspase-8，进而激活caspase-3，最终诱导凋亡[11]。因此，TRADD作为关键的调节因子，在平衡促凋亡和抗凋亡信号通路中起作用，从而影响细胞在存活和死亡之间的选择。此外，先天免疫系统是抵御病毒感染的基本防线[12]、[13]。在鱼类中，病毒感染后TRADD的转录调控已有充分记录，突显了其在先天抗病毒反应中的潜在作用，例如在黑鲤（Mylopharyngodon piceus）[14]和橙点石斑鱼（Epinephelus coioides）[15]中。此外，在斑马鱼（Danio rerio）[16]、草鱼（Ctenopharyngodon idella）[17]和橙点石斑鱼[15]中的研究表明，TRADD参与caspase介导的凋亡通路，表明TRADD在鱼类中的作用可能与哺乳动物相似。然而，其在鱼类免疫系统中的确切功能仍不够清楚。
红点石斑鱼（Epinephelus akaara）因其高市场价值和消费者需求而在亚洲国家特别受欢迎，并被视为一种新兴的水产养殖物种[18]。然而，石斑鱼养殖受到多种细菌、寄生虫和病毒疾病的严重威胁，影响石斑鱼养殖场的健康和生产力，给水产养殖业带来重大经济损失[19]。在这些病原体中，病毒性疾病对石斑鱼生产构成严重威胁，尤其是由红点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）和新加坡石斑鱼虹彩病毒（SGIV）等病毒引起的疾病[15]、[20]。为了有效管理和控制这些疾病，全面了解红点石斑鱼的免疫系统和功能基因至关重要。本研究旨在探索TRADD基因在红点石斑鱼（EaTRADD）中的免疫功能，以填补现有研究空白，并最终找到对抗石斑鱼养殖中病原体感染的新策略。
实验部分
实验鱼类
实验用的红点石斑鱼（约9个月大）来自韩国济州的一个商业养殖场。选择了体重平均为68 ± 2克、无可见疾病或异常迹象的健康鱼类作为实验对象。这些鱼被饲养在300升的鱼缸中，实验前两天除外，每天喂食一次商业鱼饲料。水温维持在26 ± 1°C，使用过滤的海水和外部曝气。
EaTRADD的分子、结构和系统发育分析
EaTRADD的cDNA序列已提交至NCBI GenBank数据库，登录号为PV822145。预测的EaTRADD开放阅读框（ORF）长度为876个碱基对，编码一个由291个氨基酸组成的蛋白质，包括N端结构域（氨基酸52–163）和C端结构域（氨基酸200–289）。EaTRADD蛋白质的预测分子量为32.5 kDa，理论等电点为5.33。SignalP分析表明该序列中不存在信号肽。EaTRADD的N端和C端结构域均
讨论
TRADD是一种关键的适配分子，在哺乳动物系统中在转导TNFR1介导的信号级联反应中起重要作用，协调多种细胞反应，包括凋亡和NF-κB信号通路的激活[6]、[30]。尽管其在哺乳动物中的功能已有充分记录，但其在低等脊椎动物（包括硬骨鱼类）中的作用仍不甚明了。本研究通过表征EaTRADD在硬骨鱼类中的功能，进一步丰富了对其作用的理解
结论
总之，本研究鉴定了硬骨鱼类中的TRADD同源物EaTRADD并对其功能进行了分析。空间和时间表达分析表明，EaTRADD可能在宿主免疫反应中发挥作用。亚细胞定位显示其参与细胞质信号传导过程。功能表征表明，EaTRADD通过激活NF-κB通路正向调节IFN信号通路相关基因并促进促炎反应
致谢
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划的支持，该计划由教育部资助（RS-2019-NR040078），以及由海洋渔业部资助的韩国海洋科学技术促进院（KIMST）的支持（RS-2022-KS221670）。
