针对IgM的单克隆抗体的特性分析以及蛇头鱼（Channa argus）中IgM+ B细胞的吞噬功能研究

《Fish & Shellfish Immunology》：Characterization of monoclonal antibody against IgM and phagocytic function of IgM+ B cells in snakehead ( Channa argus)

本研究通过纯化蛇头鱼血清IgM制备单克隆抗体，验证其特异性识别重链，并发现IgM+ B细胞在脾脏和肾头占比最高，具有吞噬荧光微球和大肠杆菌的能力。刺激后，这些B细胞增殖显著，并上调mIgM、CD79a和CD79b表达，为研究蛇头鱼IgM功能提供了新工具。

　　

彭飞木|王哲|李琦|邱华莉|刘兰浩|聂萍

中国山东省青岛市青岛农业大学海洋科学与工程学院，266109

摘要

免疫球蛋白（Ig）M（IgM）在B淋巴细胞上表达，作为B细胞受体（BCR）复合体中的跨膜抗原受体；分泌的IgM是适应性体液免疫反应的重要组成部分。能够识别IgM的单克隆抗体（mAb）是研究B淋巴细胞发育和体液免疫反应的强大工具。在本研究中，从蛇头鱼（Channa argus）的血清中纯化了IgM，并用其制备了mAb。Western blotting实验确认该mAb特异性识别蛇头鱼IgM的重链，间接免疫荧光检测（IFA）显示其能与淋巴细胞表面的膜结合IgM（mIgM）结合。流式细胞术分析（FCA）表明该mAb识别的淋巴细胞群体与Zap70⁺细胞群体不同，且IgM转录本仅存在于分选的IgM⁺淋巴细胞中。IgM⁺ B细胞在脾脏（20.94 ± 2.77%）和头部肾脏（21.04 ± 1.87%）中的比例最高，其次是外周血（15.29 ± 2.90%），而黏膜组织中的IgM⁺细胞很少（鳃部为0.46 ± 0.14%，肠道为0.95 ± 0.17%）。此外，研究还发现蛇头鱼中的IgM⁺ B细胞具有吞噬荧光微球和细菌的能力。在感染出血综合征病毒（IHSV）或细菌病原体Nocardia seriolae后，脾脏、头部肾脏和血液中的IgM⁺ B细胞增殖显著增加，同时mIgM、CD79a和CD79b的表达也上调。总之，利用针对蛇头鱼IgM制备的mAb研究了该物种中IgM⁺ B细胞的分布、增殖和吞噬功能，这为进一步探讨IgM及其在蛇头鱼中的作用提供了重要工具。

引言

超过5亿年前，有颌脊椎动物中基于B细胞和T细胞的适应性免疫系统的出现标志着免疫系统进化的一个里程碑[1]。作为体液免疫反应的核心组成部分，B细胞通过产生多种免疫球蛋白（Ig）谱型，在适应性免疫系统中发挥关键作用，这些Ig谱型能够识别多种抗原[2]。Ig具有高度特化的结构，能够特异性结合外来病原体（如细菌和病毒）[3]。在进化过程中，Ig分化为多种亚型，每种亚型在黏膜和系统免疫中扮演特定角色[4]。例如，硬骨鱼类具有三种类型的Ig：IgM、IgD和IgT。硬骨鱼类的IgM与四足动物的IgM、IgG和IgY相似，在系统免疫中起主导作用；而硬骨鱼类的IgT则类似于四足动物的IgA和IgX，在黏膜免疫中起关键作用[[5],[6],[7],[8]]。IgM是脊椎动物中最古老且保守的抗体亚型之一，在免疫反应初期对病原体提供重要防御[7]。此外，主要以四聚体形式存在的硬骨鱼类IgM是血清中最丰富的抗体类型，对系统性和黏膜性免疫反应都有贡献[[9],[10],[11]]。

过去二十年来，越来越多的证据表明B细胞也具有先天免疫功能。在虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）中，已证实B细胞在体外和体内都具有吞噬活性[12]。虹鳟鱼B细胞对颗粒的摄取会触发吞噬溶酶体的形成，从而在细胞内杀死摄入的微生物[6,12]。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的研究表明，IgM⁺浆细胞样细胞不仅具有吞噬能力，还具有抗原呈递能力[13]。研究还发现，模式蛙Xenopus laevis的B细胞中也有一部分具有吞噬功能。随后在小鼠中也观察到了类似现象，大约5%的腹腔（PerC）B细胞（主要是B1细胞）能够吞噬金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和聚苯乙烯荧光微球[14]。被吞噬的微生物在吞噬溶酶体内被有效杀死，并被加工成抗原肽呈递给T细胞[14]。这些发现表明B细胞可能起源于一种祖先的吞噬细胞类型，可能介于先天免疫和适应性免疫之间。

蛇头鱼（Channa argus）是中国重要的淡水养殖物种[15]。近年来，由细菌、病毒和寄生虫引起的传染病在蛇头鱼养殖业中日益普遍，导致重大经济损失[15]。然而，关于其免疫系统功能的资料有限，这阻碍了有效疾病控制策略的开发。在本研究中，利用蛇头鱼血清中的纯化IgM通过免疫小鼠制备了单克隆抗体（mAb），并通过间接酶联免疫吸附试验（ELISA）、Western blotting和间接免疫荧光检测（IFA）对其进行了筛选和表征。此外，还分析了外周血和免疫相关组织中IgM⁺ B细胞的分布，并利用流式细胞术研究了它们吞噬荧光微球和细菌的能力。本研究为理解蛇头鱼中IgM⁺ B细胞的吞噬功能提供了进一步证据，也为进一步研究IgM在蛇头鱼中的作用提供了重要的免疫学工具。

实验部分

鱼类与刺激实验

本研究使用的健康蛇头鱼两组（重量分别为1000 ± 80克和96.6 ± 8.9克）购自中国山东济宁的一个鱼场。这些鱼在28°C下饲养至少7天，并在免疫刺激实验前每天喂食两次商业饲料颗粒。

本研究中使用的传染性出血综合征病毒（IHSV）菌株是在我们的实验室分离并在条纹蛇头鱼细胞系E11中培养的[16]。细胞在28°C下使用L-15培养基培养。

血清IgM的纯化

为了在蛋白质水平上表征蛇头鱼IgM，使用蛋白质A亲和层析法从健康鱼血清中纯化了IgM。在还原条件下，SDS-PAGE分析显示纯化的IgM呈现两条主要条带，分子量分别为约70 kDa（重链，IgM H）和27 kDa（轻链，IgM L）（图1A）。为了确定IgM的寡聚状态，使用非还原SDS-PAGE进行了分析。

讨论

多年来，人们已经开发出针对鱼类IgM的单克隆抗体（mAb），以研究IgM的功能以及IgM⁺ B淋巴细胞的表型和功能特性[18,21,[23],[24],[25]]。在本研究中，利用纯化的蛇头鱼血清制备了一种特异性识别蛇头鱼IgM重链的mAb，并用其来表征IgM⁺ B细胞及其吞噬功能。

膜结合的IgM表达在B淋巴细胞表面：

作者贡献声明

彭飞木：撰写–原始草稿、研究、方法学、数据分析。王哲：研究、数据分析、撰写–原始草稿。李琦：验证、数据分析。邱华莉：数据可视化。刘兰浩：资源支持。聂萍：撰写–审稿与编辑、概念构思。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（NSFC）（项目编号42106135、32573545）、山东省自然科学基金（项目编号ZR2025MS500）、山东省“一流渔业学科”计划（[2020]3）以及山东省“一事一议（Yishi Yiyi）”人才计划（[2018]27）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。