对七氧化二氮（IKKα）基因和TBK1基因在七鳃鳗中的鉴定、分子进化及表达谱的全面研究

《Fish & Shellfish Immunology》：Comprehensive investigation of the IKKα gene and TBK1 gene's identification, molecular evolution, and expression profiling in lampreys

本研究鉴定了盲鳗基因组中的两个IKK家族基因Lr-IKKα和Lr-TBK1，通过系统发育、基因结构及三维结构分析证实其进化保守性，体外实验显示Lr-IKKα可显著增强NF-κB转录活性并与Lr-IκB结合，揭示其在免疫信号通路中的关键调控作用。

　　

Boting Lan|Xinyu Du|Ning Yang|Si Gao|Tiesong Li|Peng Su

辽宁师范大学生命科学学院，中国大连，116081

摘要

κB激酶（IKK）复合体的抑制剂是核因子-κB（NF-κB）信号通路的关键调节因子，在免疫功能中起着至关重要的作用。本研究从$Lethenteron reissneri$基因组数据库中发现了两个同源基因：Lr-IKK alpha（Lr-IKKα）和Lr-TANK-binding kinase 1（Lr-TBK1）。系统发育分析揭示了IKK家族在不同物种间的进化关系。通过对基序、结构域、基因结构及三维结构的进一步研究，确认了Lr-IKKα和Lr-TBK1的保守性。体外实验表明这两种蛋白质可能参与了七鳃鳗的NF-κB介导的先天免疫反应。荧光素酶实验显示Lr-IKKα显著增强了NF-κB的转录活性。共免疫沉淀实验进一步表明Lr-IKKα可能通过与七鳃鳗NF-κB抑制分子（Lr-IκB）的相互作用来调节NF-κB信号通路。这些发现为Lr-IKKα和Lr-TBK1的进化机制提供了新的见解，并为其功能提供了关键证据。

引言

七鳃鳗作为现存最原始的脊椎动物，是研究早期脊椎动物先天免疫系统起源和进化的理想模型。作为最基部的脊椎动物，七鳃鳗的NF-κB信号通路为理解脊椎动物免疫系统的进化提供了独特的视角。现有研究表明，七鳃鳗的NF-κB通路在其核心成分和免疫功能上高度保守，同时具有独特的特征。七鳃鳗拥有相对完整的TLR/Myd88/NF-κB信号通路，用于检测病原体信号并启动先天免疫反应，为研究脊椎动物先天免疫的进化提供了重要线索。

先前的研究已经鉴定并分析了七鳃鳗中TLR信号通路中多个关键分子的同源物，包括MyD88、TRAFs、IκB和NF-κB[[1], [2], [3], [4]]。2010年的一项研究通过同源性搜索发现，七鳃鳗基因组中含有16个TLR同源物，包括鱼类F型和哺乳动物M型TLR。七鳃鳗利用这套保守的M型和F型TLR来抵御微生物[5]。此外，七鳃鳗蛋白laTLR14b的二聚化可能促进人类细胞中NF-κB和IFN-β启动子的激活[6]。作为经典的NF-κB信号通路激活剂，TLR依赖于适配器来传递信号。髓系分化因子88（MyD88）作为TLR的关键适配器，在先天免疫反应中起关键的模式识别受体（PRR）作用。基因表达分析显示，感染后七鳃鳗组织（如鳃和肾脏）中的MyD88水平显著升高，表明它在TLR通路下游激活NF-κB中起关键作用[1]。我们实验室之前的研究表明，七鳃鳗的TRAFs主要表达在免疫相关组织（如白细胞和肠道）中，LjTRAF3a和LjTRAF6的过表达可在HEK293T细胞中诱导NF-κB激活[2]。此外，还在七鳃鳗中发现了四种Rel和IκB同源物[7]。七鳃鳗的NF-κB同源物（lj-NF-κB）与其人类对应物具有功能相似性[4]。

IKK复合体在七鳃鳗NF-κB信号通路中的作用尚不清楚。作为该通路的主要调节因子，IKK复合体在免疫功能中起着关键作用。NF-κB信号通路在多种刺激下被激活，导致IKK复合体（由IKKα、IKKβ和IKKγ/NEMO三个核心亚基组成）对IκB进行磷酸化[8]。除了这些核心成分外，IKK家族还包括IKK epsilon（IKKε）和TANK-binding kinase 1（TBK1）等相关蛋白[9]。IKKβ主要负责调节细胞内的IκB激酶活性，对整体IKK活性有显著影响。在缺乏IKKβ的情况下，IKKα会承担剩余的功能[10]。TBK1含有一个独特的泛素样结构域（ULD），该结构域有助于在IκBα抑制剂经蛋白酶体降解后使IKK复合体与NF-κB转录因子分离[8]。在PRR激活下，IKKε和TBK1会磷酸化关键转录因子（如IRF3、IRF7和p65/RelA），从而促进基因表达并抑制病原体复制[11]。最新研究揭示了IKK复合体的其他功能，表明它还参与将NF-κB通路与其他对免疫功能、肿瘤发生、免疫器官生长和凋亡至关重要的信号通路相连[8]。

为了更深入地了解IKK复合体的进化机制，我们从七鳃鳗基因组数据库中鉴定了IKKα和TBK1。利用生物信息学工具进行了系统发育分析、基因结构分析、序列比对和Lr-IKKα及Lr-TBK1的三维结构分析。此外，还进行了实时定量PCR实验，以研究这些蛋白在组织中的表达模式及其对病原体的免疫反应，进一步阐明了Lr-IKKα和Lr-TBK1在免疫功能中的作用。

章节摘录

动物、免疫和细胞

七鳃鳗（Lethenteron reissneri）采自中国黑龙江省松花江的通江峡谷，饲养在4°C的循环水槽中。大连医科大学研究所的动物福利与研究伦理委员会批准了所有喂养和实验方法（许可号：LL2024007）。每条鱼注射100 μg的PolyI:C（一种合成的双链RNA类似物，聚肌苷酸）和脂多糖（LPS）。

IKKα和TBK1的多序列比对分析

所有Lr-IKK序列均来自七鳃鳗（Lethenteron reissneri）基因组数据库，并通过BLAST分析进行了验证。经过多步骤筛选后，排除了冗余和重复的候选序列。本研究鉴定出两个七鳃鳗IKK基因，分别命名为Lr-IKKα和Lr-TBK1。序列分析显示，Lr-IKKα和Lr-TBK1的开放阅读框（ORFs）长度分别为2343 bp和2232 bp，编码780个和743个氨基酸。

讨论

作为无颌脊椎动物的代表，七鳃鳗是现存最原始的脊椎动物之一[15]。由于其独特的进化地位和相对原始的免疫系统，它长期以来一直被认为是研究脊椎动物免疫系统起源和进化的理想模型[16]。在本研究中，仅在七鳃鳗中发现了IKKα和TBK1基因，而IKKβ/NEMO的同源基因未发现。这表明IKKα基因可能起着更重要的作用。

作者致谢

Boting Lan：概念构思、方法设计、验证、数据分析、初稿撰写、可视化；Xinyu Du：数据管理；Ning Yang：数据管理；Tiesong Li：数据管理；Peng Su：概念构思、方法设计、审稿和编辑。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：31801973）、辽宁省自然科学基金（编号：2025-MS-272）、辽宁省教育厅项目（编号：LJ212410165069、LJKQZ2021087）、辽宁省教育厅基础科学研究项目（自然科学类）（编号：LJ212510165031）以及大连市高层次人才创新支持项目（编号：2019RQ126）的支持。我们感谢...