综述：金黄色葡萄球菌对达托霉素的耐药性和耐受性的分子机制

《International Journal of Antimicrobial Agents》：Molecular mechanisms of resistance and tolerance of Staphylococcus aureus to daptomycin

达托霉素通过钙离子与革兰氏阳性菌膜磷脂酰肌醇结合，抑制细胞壁合成并产生活性氧导致细胞死亡。耐药机制包括MprF介导的正电荷表面形成、Cls2/PgsA调控的膜磷脂修饰（如增加心磷脂比例）、ClpXP unfoldase解折叠错误蛋白维持细胞壁完整性，以及WalKR、GraXSR、VraTSR等两组分系统通过调控peptidoglycan合成和转运蛋白表达协同耐药。耐受性则涉及持存者表型、生物膜形成及代谢通路（如TCA循环）改变，降低达托霉素杀菌活性。研究还发现耐药与β-内酰胺类抗生素的“ seesaw效应 ”相关，即达托霉素耐药可能伴随β-内酰胺类敏感性变化。

　　### 一、引言

金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）是一种重要的病原体，它在血流感染（bacteraemia）中占据主导地位，其致死率在不同地区存在显著差异。在欧洲，金黄色葡萄球菌血流感染的死亡率约为15%-60%，而在美国则为10%-30%。澳大利亚的数据显示，金黄色葡萄球菌血流感染的30天全因死亡率为17.5%，而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的死亡率则高达21.4%，显著高于对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）的16.8%。这种病原体能够引发多种感染，包括软组织感染（SSTI）和系统性感染，如骨髓炎和心内膜炎。尽管不同地区的MRSA血流感染标准治疗方案有所差异，但万古霉素和达托霉素（daptomycin）通常被认为是首选的抗菌药物。

达托霉素是一种环状脂肽类抗生素，自2003年起被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗软组织感染，剂量为4 mg/kg/天；随后于2006年被批准用于治疗右心内膜炎和血流感染，剂量提升至6 mg/kg/天。2022年，澳大利亚治疗产品管理局（TGA）也批准了达托霉素用于治疗软组织感染和血流感染。达托霉素具有杀菌作用，其效果不受细菌生长阶段的影响。在临床应用中，达托霉素作为一线和二线治疗药物时，其有效性分别达到83.0%和79.2%。然而，达托霉素的杀菌活性在六小时后可能下降，这可能与生物膜形成和细菌耐受性增加有关。此外，达托霉素的杀菌效果具有浓度依赖性，特别是在深部感染和高菌量感染中，可能导致耐药性的增加。因此，在复杂和严重的感染中，达托霉素通常与其他抗菌药物联合使用，如庆大霉素、利福平、利奈唑胺、复方新诺明或β-内酰胺类药物。相比万古霉素，达托霉素治疗能够减少后续治疗需求、住院天数和MRSA血流感染的死亡率（20% vs. 48.2%）。

### 二、达托霉素耐药的分子机制

#### 2.1. 多肽耐药因子（MprF）

达托霉素耐药的金黄色葡萄球菌通常携带MprF基因的突变。MprF是一种膜蛋白，能够将带负电的磷脂酰甘油（PG）转化为带正电的赖氨酸-磷脂酰甘油（LPG），从而增加细菌细胞表面的正电荷。这种正电荷的变化会通过静电排斥作用阻止达托霉素与细胞膜的结合，降低其抗菌效果。在pH 7的条件下，金黄色葡萄球菌的细胞膜主要由55%的PG、40%的LPG和5%的心磷脂（CL）组成。PG在生长阶段积累，而在静止阶段则转化为CL和LPG。MprF通过替换PG的头部基团为带正电的赖氨酸或精氨酸，形成带正电的脂质，从而增加细胞膜的正电荷。

MprF由840个氨基酸残基组成，包含一个疏水的LPG转运结构域（残基1-298）、一个亲水的LPG合成结构域（也称为赖氨酸化结构域，残基299-840）以及一个连接两者的双功能结构域（残基278-355）。为了合成LPG，合成结构域催化从Lys-tRNA向PG的甘油部分的游离末端羟基转移氨基酸基团。随后，转运结构域将LPG翻转至外膜，进一步增加细胞表面的正电荷。达托霉素耐药通常需要合成和转运结构域的活性。因此，大多数MprF的“热点”突变（如Ser295、Pro314、Ser337、Leu341、Thr345和Val351）位于双功能结构域。然而，并非所有双功能结构域的突变（如I348del和S337L）都会增加细胞表面的正电荷。相反，一些“热点”突变位于赖氨酸化结构域（如W424R、L431F、L826F和S829L）可能会激活VraSR双组分系统，导致muropeptide的过表达。这些突变通常与厚壁和对万古霉素的协同耐药有关。

#### 2.2. 心磷脂合成酶（Cls）

在暴露于较高浓度达托霉素后，金黄色葡萄球菌可能会改变心磷脂（CL）和PG的组成，以调节细胞膜的流动性。CL具有独特的倒锥形结构，能够调节膜弯曲并紧密排列脂质。因此，富含CL的膜结构会更加厚实和刚性，从而阻碍达托霉素的附着和渗透。金黄色葡萄球菌含有两个CL合成酶基因，*cls1*和*cls2*，它们能够将两个PG分子转化为一个CL和一个甘油分子。在静止期，*cls2*是主要的活性基因，而在中性粒细胞吞噬过程中，*cls1*和*cls2*都会被激活。

Cls1和Cls2分别由493和494个氨基酸残基组成，具有53%的氨基酸同源性，并且含有两个相似的跨膜结构域（TMDs）（残基15-38和48-70）。在达托霉素耐药的金黄色葡萄球菌中，*cls2*的突变通常位于TMDs区域（如Ala23、Thr33、Leu52和Phe60），这些突变会增强CL的合成并减少PG的含量。相比之下，*cls1*的突变在达托霉素耐药中较少见，且尚未发现其对达托霉素耐药的具体贡献。

#### 2.3. 磷脂酰甘油磷酸合成酶（PgsA）

类似地，PgsA的突变通常在高浓度达托霉素选择压力下出现。PgsA能够将胞苷二磷酸二酰甘油（CDP-DAG）和甘油3-磷酸转化为胞苷单磷酸和PG磷酸，后者随后被去磷酸化为PG。PgsA由192个氨基酸残基组成，包含六个TMDs（残基4-23、41-66、71-96、101-122、132-148和163-185）。PG磷酸的3’-磷酸基团位于催化位点，跨越TMD2-5区域。在达托霉素耐药的金黄色葡萄球菌中，PgsA的突变通常位于TMD2（Val59、Gly61和Ala64）、TMD3（Gly74、Lys75和Asp78）和TMD6（Ser177），这些突变会降低PG的合成能力，从而减少细胞膜的负电荷。

此外，PgsA的突变还可能增加直链脂肪酸的水平，这些脂肪酸在PG合成通路上游积累，可能通过影响膜的流动性来增强细菌对达托霉素的耐受性。直链脂肪酸的含量与膜的刚性密切相关，而支链脂肪酸则通过双键的弯曲作用增加膜的流动性。因此，达托霉素耐药的金黄色葡萄球菌中，直链脂肪酸的增加可能是导致膜结构改变的重要因素。然而，当缺乏*cls2*或*pgsA*突变时，金黄色葡萄球菌的膜可能更加柔软，这可能是其在体内对达托霉素表现出较高耐受性的原因。

#### 2.4. 折叠酶蛋白（PrsA）

膜流动性可能会影响其他细胞壁活性抗菌药物的疗效。在大多数细菌中，细胞壁由交替的*N*-乙酰葡萄糖胺和*N*-乙酰胞壁酸链通过短的茎肽连接而成。细胞壁的合成主要由青霉素结合蛋白（PBPs）完成，包括糖链的连接（转糖基化）和链间的交联（转肽化）。PBPs还参与将脂质II整合到生长的细胞壁网络中，以加速转糖基化和转肽化过程。β-内酰胺类药物通过形成稳定的酰酶复合物，不可逆地抑制PBPs，从而干扰细胞壁的合成。

金黄色葡萄球菌含有四个PBPs（PBP1、PBP2、PBP3和PBP4），而MRSA则携带额外的PBP2a，该蛋白由*mecA*基因编码。尽管β-内酰胺类药物对PBPs的亲和力不同，但PBP2a对大多数β-内酰胺类药物的亲和力较低。为了赋予β-内酰胺类药物的耐药性，PBP2a在翻译后经历折叠，这一过程由PrsA折叠酶介导。PrsA由320个氨基酸残基组成，包含一个催化转角化的蛋白激酶结构域（残基140-245），该结构域催化寡肽中脯氨酸酰胺键的异构化。功能失调的PrsA会减少CL、PBPs和细胞壁交联的水平。此外，MprF的突变可能会导致PrsA活性的变化，进而影响细胞壁的合成和结构。

#### 2.5. ClpXP展开酶复合物

与“跷跷板效应”不同，达托霉素和*mecA*非依赖的β-内酰胺类药物协同耐药性也可能由ClpXP展开酶复合物介导。ClpXP是一种蛋白质展开酶复合物，能够展开和降解缺陷蛋白。功能失调的ClpXP会增加细胞壁交联和细胞壁碎片（muropeptides）的积累。这些muropeptides作为信号分子，可以激活细胞壁合成并缓解由RpoB突变引起的生长缺陷和适应成本。此外，ClpXP还可能通过调节其他基因，如*agr*，影响细菌的毒力和生物膜形成。

ClpX展开酶由420个氨基酸残基组成，包含一个锌结合结构域（残基1-54）用于识别底物，以及一个由大结构域（残基1-260）和小结构域（残基261-420）组成的AAA+模块。该模块负责将展开的底物转移到ClpP蛋白酶的降解腔中。ClpX的功能失调可能会导致RpoB突变引起的生长缺陷和适应成本的缓解，但同时会引发提前的子细胞分离，这在缺乏LtaS或暴露于亚致死浓度的青霉素时可以被抑制。ClpP展开酶由195个氨基酸残基组成，形成两个七聚体环包围降解腔。功能失调的ClpP会干扰热休克反应、金属稳态和SOS反应。此外，ClpP的突变可能导致细菌形成杆状形态，以减少达托霉素对细胞壁分裂部位的结合，从而抑制其向内进展。

#### 2.6. RNA聚合酶亚基（RpoBC）

除了β-内酰胺类药物的协同耐药，达托霉素耐药可能与RpoB或RpoC的突变相关。RpoB和RpoC是细菌DNA依赖性RNA聚合酶的β-和β’-亚基，形成蟹钳状的核心结构，包裹核苷酸结合凹槽。RpoB由1183个氨基酸残基组成，包含两个高度保守的利福平耐药决定区：Rifampicin Resistance Cluster I（残基462-488）和Cluster II（残基515-530）。利福平通过结合并阻断RpoB的出口通道，抑制其转录功能。RpoB的突变会导致利福平耐药，而RpoB H481Y突变会破坏利福平与RpoB之间的氢键，减少其与利福平的结合能力。此外，RpoB H481Y突变可能促进带负电的荚膜多糖的合成，从而阻碍达托霉素进入细菌膜。

RpoB和RpoC的突变还可能导致对万古霉素的耐药性。RpoB的某些突变（如R512P）与“慢速万古霉素中介型金黄色葡萄球菌”（VISA）相关，表现为生长缓慢、不稳定的耐药性、不规则的菌落形态和高水平的青霉素耐药。这些突变可能通过干扰RNA聚合酶的转录功能，导致细胞壁合成前体的积累，从而增强细胞壁的厚度，防止青霉素的渗透。同时，这些突变可能与达托霉素和万古霉素的协同耐药有关。

#### 2.7. 双组分系统

上述与达托霉素耐药相关的蛋白质表达可能受到环境信号通路的调控。这些信号通路通常涉及双组分系统，它们通过感知外界刺激，调节与细胞壁合成相关的蛋白质。金黄色葡萄球菌基因组中包含16个已知的双组分系统，而MRSA还携带一个额外的SCC*mec*岛。典型的双组分系统由一个组氨酸激酶和一个响应调节因子组成，其中激酶通过跨膜、胞外或胞内感知结构域检测外界刺激，并在保守的组氨酸残基上进行自磷酸化。随后，磷酸化的激酶将磷酸基团转移至响应调节因子的天冬氨酸残基上。

VraSR是与达托霉素耐药相关的双组分系统，它通过VraT感知抗菌肽，并调节与细胞壁合成相关的基因。VraT具有一个胞外的C端尾部，可能参与抗菌肽的感知，并且是细胞壁响应蛋白LiaF的同源物。然而，与LiaF不同，VraT通过自磷酸化VraS来正向调节VraSR。VraSR的完全激活需要VraT的存在。此外，VraSR的过表达可能增强达托霉素或万古霉素的耐药性，而VraF的突变则可能上调*mprF*和*dltB*，进一步增强耐药性。

#### 2.8. 胞壁霉素耐药相关信号调节因子（BraSR）

BraSR（也称为NsaSR）参与生物膜形成、细胞壁损伤响应以及对胞壁霉素和尼西林的耐药。BraS激酶由295个氨基酸残基组成，包含两个跨膜结构域（残基5-24和34-50），以及一个含有组氨酸和谷氨酸的两性离子胞外环。在对胞壁霉素和尼西林的响应中，BraSR激活ABC转运蛋白BraDE和VraDE。BraDE参与抗菌肽的感知和信号传导，而VraDE则负责将胞壁霉素和尼西林排出细胞。VraDE还可能通过小跨膜蛋白VraH的辅助作用，检测达托霉素并赋予高水平的达托霉素耐药性。

#### 2.9. 达托霉素异源耐药和耐受性

尽管只有0.1%-0.3%的金黄色葡萄球菌被报道为达托霉素耐药，但全球范围内有20%-30%的MRSA血流感染病例未能通过达托霉素治疗。这种治疗失败可能与达托霉素耐受性或异源耐药有关。异源耐药是指在整体敏感的菌株中存在耐药的亚群，这给MIC检测带来了挑战。耐受性则指细菌在接触杀菌性抗菌药物后仍能存活，但其MIC保持不变。耐受性机制尚未完全明确，但研究表明，某些与中央代谢相关的通路可能通过减少ATP合成和生长速率，提高细菌对达托霉素的耐受性。

在体外，达托霉素耐受的金黄色葡萄球菌可能在达托霉素浓度高达32 mg/L的环境中存活，这比其指数期生长的菌株（在2 mg/L浓度下）的耐受性高15倍。这种现象可能与细菌进入某种休眠状态有关，如持久菌或小菌落变异体。持久菌是一种非遗传性耐药的细胞亚群，其特点是双相杀菌曲线和在抗菌药物去除后能够重新生长为敏感群体。持久菌的形成可能与三羧酸循环的失活、核糖体的减少以及某些蛋白的过表达有关。这些蛋白可能通过引入突变，使细菌从耐受状态转变为异源耐药状态。

小菌落变异体是另一种耐受机制，它们的菌落大小仅为野生型的五到十倍。这种现象可能与电子传递链（如SnoF）或甲基醌途径（如HepT）的突变有关，这些突变可能导致ATP和细胞壁多糖的合成减少。在微需氧条件下，电子传递主要由NADH氧化还原酶（如SnoA-G）介导。功能正常的电子传递依赖于异戊烯化物合成辅因子，如类胡萝卜素、醌类和血红素，以维持正常的菌落形态。异戊烯化物的合成涉及甲基醌途径，其中HepT是关键的多聚异戊烯二磷酸合成酶，负责链延伸。尽管达托霉素能够穿透免疫细胞（如中性粒细胞和巨噬细胞），但电子传递的丧失可能导致膜电位下降，从而阻碍达托霉素的孔形成和渗透。

此外，ATP合成的减少可能导致细胞内无机磷酸盐的积累，进而上调无机磷酸盐转运蛋白PitA，促进*dlt*基因的表达。*dlt*基因编码的DltABCD蛋白能够对脂磷壁酸（LTA）进行*dl*-赖氨酸化，从而减少脂质II的含量并增加细胞表面的正电荷。LTA合成涉及五个组分，其中前三个组分参与Glc2DAG的合成，而Glc2DAG是LTA组装的膜锚定物。达托霉素通过与LTA合成中的下游蛋白（如LtaA和LtaS）相互作用，影响其在细胞膜中的分布。功能失调的LtaS可能导致较短的LTA合成，影响YSIRK前体的运输，从而影响达托霉素的结合。

#### 2.10. 生物膜形成

生物膜是由多层细胞组成的结构，被包裹在由多糖、蛋白质和细胞外DNA组成的胞外基质中。除了作为机械性（如剪切力）和抗菌性（如达托霉素）的保护屏障外，生物膜还为耐药性编码的质粒交换和宿主免疫反应的逃避提供了理想的微环境。尽管达托霉素能够穿透MRSA生物膜，但其与膜靶标的相互作用可能受到生理变化的影响。为了在不利环境中存活，生物膜细胞可能采用多种休眠表型，如持久菌或小菌落变异体。

#### 2.11. 持久菌

持久菌是抗菌药物处理后形成的非遗传性耐药细胞亚群，其特点是双相杀菌曲线和在抗菌药物去除后能够重新生长为敏感群体。持久菌的形成通常与三羧酸循环的失活、核糖体的减少以及某些蛋白的过表达有关。这些蛋白可能通过引入突变，使细菌从耐受状态转变为异源耐药状态。例如，某些与达托霉素异源耐药相关的突变可能发生在核糖体（如RplV和RpsU）或tRNA氨基酸连接酶（如ThrS）中，这可能与转录相关的突变有关。

持久菌的形成还可能与SOS响应、严格响应和*agr*系统的相互作用有关。SOS响应是由于氧化应激引起的DNA损伤，通过RexAB（也称为AddAB）的螺旋酶/核酸酶作用，通过同源重组修复DNA双链断裂。严格响应则由RelA/SpoT同源物激活，通过氨基酸饥饿或RelP和RelQ激活，导致警报分子（如鸟苷四磷酸和鸟苷五磷酸）的过量生成。RelP和RelQ是VraSR细胞壁应激调控子的一部分。*agr*系统是一种典型的群体感应系统，由组氨酸激酶AgrC和响应调节因子AgrA组成。AgrA直接结合到*psm*操纵子启动子，以过表达PSM（肽聚糖水解酶）促进生物膜的成熟和分散。

PSM可能通过与PG、LPG或CL的释放相互作用，防止达托霉素的失活。因此，抑制*agr*或上调碱性休克蛋白Asp23可能会增强达托霉素的耐受性。此外，*mecA*的表达可能抑制PSM的表达，使MRSA比MSSA更能耐受达托霉素。因此，功能失调的*agr*、Asp23或其膜锚定蛋白AmaP可能会上调*VraSR*和*prsA*，进一步增强达托霉素的耐受性。

#### 2.12. 小菌落变异体

抗菌药物暴露可能延长细菌的滞后期，形成小菌落变异体，这是一种能够存活于细胞内的细菌亚群。小菌落变异体的菌落大小仅为野生型的五到十倍，这可能与电子传递链（如SnoF）或甲基醌途径（如HepT）的突变有关。这些突变可能导致ATP和细胞壁多糖的合成减少，从而影响细菌的生长和代谢。在微需氧条件下，电子传递主要由NADH氧化还原酶（如SnoA-G）介导。功能正常的电子传递依赖于异戊烯化物合成辅因子，如类胡萝卜素、醌类和血红素，以维持正常的菌落形态。

异戊烯化物的合成涉及甲基醌途径，其中HepT是关键的多聚异戊烯二磷酸合成酶，负责链延伸。尽管达托霉素能够穿透免疫细胞（如中性粒细胞和巨噬细胞），但电子传递的丧失可能导致膜电位下降，从而阻碍达托霉素的孔形成和渗透。此外，ATP合成的减少可能导致细胞内无机磷酸盐的积累，进而上调无机磷酸盐转运蛋白PitA，促进*dlt*基因的表达。*dlt*基因编码的DltABCD蛋白能够对脂磷壁酸（LTA）进行*dl*-赖氨酸化，从而减少脂质II的含量并增加细胞表面的正电荷。

LTA的合成涉及五个组分，其中前三个组分参与Glc2DAG的合成，而Glc2DAG是LTA组装的膜锚定物。达托霉素通过与LTA合成中的下游蛋白（如LtaA和LtaS）相互作用，影响其在细胞膜中的分布。功能失调的LtaS可能导致较短的LTA合成，影响YSIRK前体的运输，从而影响达托霉素的结合。由于LtaS受MprF的正向调控，某些具有功能增强的LtaS突变可能赋予达托霉素异源耐药性，这可能是通过上调*mprF*从而实现完全耐药的一个途径。

此外，位于脂磷壁酸合成通路上游的“区域延伸协调蛋白”（CozE）的缺失也可能导致细胞壁增厚和细胞体积减小。这些变化可能进一步阻碍达托霉素的渗透。同时，*dlt*基因的激活可能由GraSR通过PrkC的磷酸化作用实现，从而增加CL的合成。这一过程可能与细胞壁的结构变化有关，进而影响达托霉素的抗菌效果。

### 三、结论

金黄色葡萄球菌对达托霉素的耐药性是一个复杂的多因素过程。虽然MprF突变导致细胞表面正电荷增加是主要的耐药机制，但金黄色葡萄球菌还可能通过双组分系统感知达托霉素的威胁，并通过调控参与细胞壁合成的蛋白质网络来改变膜结构。此外，达托霉素耐药可能在耐受性之后发生，而耐受性则可能通过抑制中央代谢中的关键成分（如ATP合成）和增强某些蛋白质（如核糖体和tRNA氨基酸连接酶）的表达来实现。这些蛋白质的过表达可能引入突变，使细菌从耐受状态转变为异源耐药状态。

未来的研究应关注从达托霉素耐受性到耐药性的进化路径，这可能为开发新的抗菌药物靶点提供线索。同时，探索达托霉素与其他非β-内酰胺类药物（如蛋白质合成抑制剂）的协同作用，可能为联合治疗提供新的策略。此外，理解达托霉素耐药与耐受性的分子机制，有助于优化治疗方案，减少耐药性的发生。通过深入研究这些复杂的机制，科学家们可以更有效地应对金黄色葡萄球菌对达托霉素的耐药问题，提高临床治疗的成功率。