利用综合液相色谱-电荷还原质谱分析技术，在生物治疗药物生产中对聚氧乙烯188（Poloxamer 188）进行快速分析、指纹图谱识别及种类鉴定

高分辨率液相色谱-质谱联用技术用于分析聚氧乙烯-聚丙氧乙烯共聚物188（P188）及其降解产物的化学特性，建立 reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) 和 strong anion exchange liquid chromatography (SAX-LC) 两种方法，结合电荷还原质谱和二维离子密度图技术，实现P188分子量分布、杂质（如聚氧乙烯和聚丙氧乙烯）及降解产物的快速鉴定与定量分析，为生物制药中P188的质量控制和稳定性研究提供解决方案。

　　

Poloxamer 188（P188）作为生物制药中常用的非离子型表面活性剂，在替代传统多糖表面活性剂（如多糖蓖麻油苷20/80，PS 20/80）方面展现出显著优势。其分子结构为三嵌段共聚物，由亲水性的聚乙二醇（PEO）和聚丙二醇（PPO）交替构成，能够有效稳定蛋白质药物、抑制细胞膜裂解，并降低蛋白质聚集风险。然而，P188的复杂多相结构（含多种嵌段比例和杂质）导致其质量评估与稳定性监测面临严峻挑战，尤其在与其他生物活性成分共存的制剂中。### 质量评估与稳定性分析的技术突破

研究团队针对P188的分析难题，创新性地整合了液相色谱技术（LC）与多维质谱成像技术，构建了覆盖原材料、制剂及降解产物的全链条分析方法。核心贡献体现在以下两个方向：**1. 原料质量的多维度解析技术**

通过 reversed-phase LC（反相液相色谱）与电荷还原高分辨质谱联用（CRMS），实现了P188分子族的结构指纹解析。该方法的关键在于引入三乙胺（TEA）作为电荷还原剂，通过调控质谱离子源的电荷状态，有效抑制高分子量聚合物（>8400 Da）的碎片化，保留其完整分子离子峰。实验显示，在电荷还原条件下，P188分子呈现2+至5+的多电荷态分布，其质荷比（m/z）特征峰集中在3000-5500 Da区间，而低分子量杂质（如PEO、PPO单体）则因电荷状态不同（1+或2+）形成独立分离带。**2. 制剂中痕量P188的在线检测体系**

针对生物药制剂中P188与生物大分子（如抗体）的复杂共存问题，开发了 strong anion exchange LC（强阴离子交换色谱）与电荷检测器（CAD）联用的新方法。该体系通过离子交换柱实现蛋白质的在线剥离，再利用反相柱分离表面活性剂与杂质。实验证明，在含抗体（150 mg/mL）的制剂中，P188（0.02% w/v）与PEO杂质（200-800 Da）在6.5分钟处形成特征分离峰，信噪比提升40%以上，定量下限达到0.01% w/v。### 关键发现与质量控制启示

**原料批次差异的分子诊断**

对三个不同供应商的P188批次进行2D离子密度图谱对比，揭示了质量差异的分子特征：

- **批次A**：高分子量P188（6000-9400 Da）占比达85%，仅含微量PEO单体（<5%），其离子分布呈现典型的"双峰"特征，主峰位于m/z 4200（Z=2）和m/z 4400（Z=2）。

- **批次B**：高分子量P188比例下降至72%，伴随PEO单体向更高分子量延伸（最高达5200 Da），推测存在过度聚合现象。

- **批次C**：除正常PEO杂质外，检测到聚丙二醇（PPO）特征离子峰（m/z 550-1800 Da），该结果与之前报道的PPO杂质导致细胞培养性能异常的案例高度吻合。**降解动力学的创新性研究**

通过铁离子（Fe3?）催化氧化模拟生物制剂储存条件，发现：

- P188在pH 5.5的酸性环境中对热（40℃）和机械应力（持续搅拌）表现出优异稳定性，1个月处理后仍保持98%以上的主峰强度。

- 降解副产物主要包括：

1. PEO链断裂产生的低聚物（200-800 Da），其丰度与储存时间呈正相关；

2. PPO链段形成（m/z 550-1800 Da），该杂质与细胞毒性存在剂量依赖关系；

3. PEO-PPO嵌段共聚物（m/z 2500-4000 Da），可能通过分子内氧化缩合形成。**制剂分析的标准化流程**

建立的标准操作程序（SOP）包含：

1. **前处理模块**：采用固相萃取（SPE）去除抗体，避免色谱柱堵塞；

2. **梯度优化策略**：通过溶剂程序实现宽分子量范围（200-10000 Da）的基线分离；

3. **双模检测机制**：

- 质谱模式：用于结构鉴定，如区分PEO（44 Da重复单元）与PPO（58 Da重复单元）；

- 电荷检测器模式：实现0.01% w/v浓度级别的定量分析，线性范围达25%-150%标定值。### 工业应用价值与改进方向

该技术体系已成功应用于：

- **原料供应商审计**：通过对比不同批次的2D离子图谱，建立供应商质量分级模型；

- **生物药稳定性研究**：在单抗制剂中实现P188与降解产物的动态监测，预警窗口缩短至72小时；

- **工艺优化指导**：发现聚合阶段的水分控制（<0.5%）可降低PEO单体生成量达60%。未来改进方向包括：

1. 开发自动进样系统，将检测通量提升至200 samples/h；

2. 引入人工智能算法，实现图谱的自动化解析与质量评分；

3. 扩展检测范围至其他聚醚类表面活性剂（如Pluronic F108）。### 质量控制体系的升级路径

基于上述研究成果，建议生物制药企业建立三级质量控制体系：

1. **一级监控**：供应商需提供CRMS谱图数据库，包含至少5个典型批次的2D离子分布特征；

2. **二级验证**：采用SAX-LC-CAD方法进行入厂检验，重点检测PPO等高风险杂质；

3. **三级追踪**：在生物药全生命周期中持续监测P188的降解动态，特别是与pH、离子强度等制剂参数的关联性。该技术突破为解决表面活性剂分析的世界性难题提供了新范式，其核心价值在于将原本实验室级的复杂质谱分析，转化为可规模化的在线检测体系，使P188的质量控制从"事后检测"升级为"过程保障"。