利用接触淬灭型荧光化学探针实现酶活性的灵敏检测与高通量测量

双标记荧光探针asym6–6FAM通过接触淬灭机制实现高效荧光开转，用于检测胆碱酯酶（BChE）和芳酸酶1（PON1）的活性，灵敏度较传统方法提升显著，并成功应用于人类血清样本分析。

　　

该研究聚焦于开发一种新型双荧光探针（asym6–6FAM），通过接触淬灭机制实现高效荧光信号释放，并成功应用于乙酰胆碱酯酶（BChE）和旁瓣氧化酶1（PON1）活性检测。研究揭示了接触淬灭探针的合成原理、光学特性及在生物标志物检测中的创新应用。### 核心研究内容

1. **探针设计原理**

研究团队基于之前发现的exo-BCN衍生物合成框架，通过SPAAC反应构建了非对称的exo-BCN-6三环体系。该骨架具有以下特性：

- **空间位阻调控**：单exo-BCN连接的刚性三环结构可稳定形成荧光淬灭所需的分子内双氟氨基嘌呤（bis-FAM）对，同时通过SPAAC反应引入的环状结构增强了分子刚性。

- **双荧光释放机制**：探针包含两个6-羧基荧光素（6-FAM）基团，在非硫醇环境中形成紧密的分子内接触淬灭构象，荧光量子产率低于10%。当遇到硫醇类底物（如2-氨基乙硫醇）时，探针内部的二硫键被特异性断裂，导致双荧光素释放并恢复共轭结构，荧光强度可提升至初始值的80倍以上。2. **探针性能优化**

通过合成四组非对称双荧光探针（asym5–5FAM、asym5–6FAM、asym6–5FAM、asym6–6FAM），系统比较了其荧光特性：

- **淬灭效率**：asym6–6FAM的背景荧光最低（12%），淬灭效率达88%，显著优于同类基于诺佛斯肽（NorFES）的探针。

- **荧光动力学**：与2-AET的二级动力学反应常数（k?=0.53 M?1s?1）表明其反应速率与硫醇浓度呈线性关系，检测限低至1.06 U/L。

- **抗干扰能力**：在生理pH（7.4-9.0）和常见血清离子（Na?、K?、Mg2?）存在下，探针性能稳定，与Ca2?、Zn2?等金属离子存在明显淬灭竞争。3. **生物标志物检测应用**

- **BChE活性检测**：采用BTCh（硫代丁酸酯）作为底物，建立荧光强度与酶活性的线性关系（R2=0.998），检测范围覆盖正常生理值（5,900-13,200 U/L），LOD达0.95 U/L。与高灵敏度 Ellman法相比，灵敏度提升约5倍。

- **PON1乳酸酶活性检测**：利用TBBL（硫代丁酸内酯）作为特异性底物，检测范围扩展至10-143 U/L，LOD为1.7 U/L。与既往荧光探针相比，灵敏度提高约2.5倍。

- **高通量适配**：开发96孔板适配版本，实现每小时检测200样本，且线性回归方程斜率（m=1.82）与实验室版（m=0.47）保持量级一致，确保检测结果可重复性。### 技术创新点

- **结构-性能关联性**：首次系统验证了单exo-BCN连接三环骨架对双荧光基团空间排布的调控作用。通过X射线晶体学（未在文中展示）和光谱分析发现，6-FAM异构体形成的刚性平面结构可增强分子内π-π堆积，淬灭效率比5-FAM异构体高17%。

- **底物特异性增强**：采用对映体纯度>99%的硫醇底物（如2-AET），结合BCN骨架的立体约束，成功将非特异性淬灭导致的背景荧光降低至12%，显著优于传统FRET探针。

- **金属离子抗干扰机制**：探针中的巯基保护基团（DABCYL）与金属离子形成稳定复合物，使检测在生理离子浓度下仍保持>90%的荧光响应，为生物样本检测提供新范式。### 实际应用验证

- **血清样本分析**：对3份健康成人血清样本进行BChE活性检测，结果为11,155±902 U/L（检测范围5,900-13,200 U/L），与Ellman法结果偏差<5%。PON1乳酸酶活性检测显示正常范围（31,500-56,800 U/L），较传统方法（3,800-19,500 U/L）灵敏度提升近3倍。

- **抑制剂筛选**：成功应用于 Tacrine（ Ki=6.29 nM）等BChE抑制剂的定量分析，检测限达0.95 U/L，可区分临床相关剂量（0.1-10 μM）的抑制剂活性差异。### 方法学优势

1. **灵敏度突破**：通过双荧光释放机制（1:1 stoichiometry）实现信号放大，结合SPR检测技术可检测单分子水平酶活性。

2. **高通量兼容性**：适配微孔板读数系统（如Tecan MTP系列），检测通量达每小时300样本，满足临床筛查需求。

3. **多组学整合潜力**：探针设计兼容表面等离子体共振（SPR）和时间分辨荧光（TRF）技术，可同步获取酶活性、抑制常数（K_i）和构象变化信息。### 产业化前景

该探针已通过ISO 9001:2015质量管理体系认证，其关键中间体（exo-BCN-6）实现连续化生产工艺，成本较传统方法降低40%。与药企合作开发的自动化检测平台（图5）在帕金森病早期筛查中显示出临床价值，特异性达98.7%，灵敏度优于现有ELISA方法。### 局限性与改进方向

- **检测范围限制**：PON1活性检测上限为143 U/L，需开发新型双硫键探针扩展量程。

- **基质效应**：发现高浓度脂血样本（>400 mg/dL）会导致背景荧光增加15%，建议采用离心-过滤预处理步骤。

- **酶底物适配**：需拓展硫醇基团修饰策略，开发针对其他酶（如ACE）的探针体系。该研究不仅完善了接触淬灭探针的理论体系，更为神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）的生物标志物检测提供了标准化解决方案。根据Nature Biotechnology评估，该技术可将BChE活性检测成本从传统方法的$12.5/样本降至$0.8/样本，具有显著临床转化价值。