揭示从芽孢杆菌（Bacillus sp.）中提纯的抗真菌脂肽在体外对抗念珠菌（Candida）混合菌膜时的抗菌效果

抗真菌脂肽AF4和AF5通过破坏混合生物膜结构并诱导细胞凋亡显著抑制了C. glabrata和C. tropicalis的生物膜形成及代谢活性，流式细胞术和TUNEL染色证实其诱导DNA碎片化，协同氟康唑效果更佳。

　　

近年来，多微生物真菌感染已成为全球公共卫生领域的重大挑战，尤其是非白色念珠菌（Candida non-albicans）的混合生物膜感染。此类感染具有高致死率和耐药性，其生物膜结构由真菌细胞、细菌共生体及多糖外基质（EPS）共同构成，形成物理屏障和代谢协同网络，显著降低传统抗真菌药物的疗效。针对这一临床难题，研究团队从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中分离出两种新型脂肽（AF4和AF5），通过系统性的体外实验揭示了其广谱抗生物膜活性及作用机制。### 1. 研究背景与意义

非白色念珠菌（如Candida glabrata和Candida tropicalis）因其生物膜形成能力与临床耐药性双重特性，已成为侵袭性真菌感染的主要病原体。世界卫生组织2022年将其列为高优先级病原体，其引发的系统性感染占住院患者的12%-15%，死亡率达30%以上。传统广谱抗真菌药氟康唑（FLC）对成熟生物膜的渗透性差，且易诱导微生物耐药突变。因此，开发新型抗生物膜策略迫在眉睫。研究团队基于前期发现（(AF4和AF5对单菌种生物膜的抑制效果）），首次构建了C. glabrata与C. tropicalis的混合生物膜模型，模拟临床多菌种共感染场景。该模型突破传统单一菌种研究局限，更真实地反映了生物膜在复杂宿主环境中的动态特性，为抗生物膜药物研发提供了关键实验平台。### 2. 实验设计与核心发现

#### 2.1 脂肽作用谱的扩展验证

通过预实验筛选发现，AF4（分子式Asn-Pro-Tyr-Asn-Gln-Thr-Ser-C15:0）和AF5（同源序列但含不同碳链长度，如C17:0）对白色念珠菌（C. albicans）以外的非白色念珠菌具有显著抑制活性。本实验重点验证了两种脂肽对混合生物膜的协同效应：

- **生物膜抑制谱**：AF4在8-16 μg/mL浓度下对混合生物膜的抑制率达84%-93%，显著优于AF5（30%-55%）。当联合使用FLC（32-128 μg/mL）时，AF4与FLC的协同效应可使生物膜代谢活性降低至89.57%，而AF5与FLC组合仅达55.74%。

- **时间依赖性**：AF4对新生生物膜（6小时）的抑制效果优于成熟生物膜（24小时），可能与脂肽对初生EPS合成酶的抑制有关。成熟生物膜需通过破坏既有EPS结构实现清除，AF4的疏水链长度（C15/C17）使其更易穿透生物膜外层脂质层。#### 2.2 空间结构解析与作用机制

通过多尺度显微分析（SEM、CSLM）和化学谱学（ATR-FTIR）揭示了脂肽的作用路径：

- **生物膜微结构破坏**：AF4处理组（16 μg/mL）的扫描电镜显示，真菌丝状结构断裂成单个细胞，外层多糖层（EPS）厚度减少62%（通过硫酚-硫酸法量化）。而AF5的细胞壁穿透性较弱，仅观察到细胞表面褶皱。

- **EPS组分特异性损伤**：FTIR光谱分析表明，AF4显著降低生物膜中磷酸酯（~1250 cm?1）和蛋白质酰胺键（1647 cm?1）的特征峰强度，提示其通过干扰EPS的糖苷键交联网络发挥作用。AF5则主要作用于脂多糖的甲基化峰（~1080 cm?1）。

- **动态代谢抑制**：XTT活性检测显示，AF4在8 μg/mL浓度下即可阻断混合生物膜中葡萄糖代谢流（降低率达86.99%），而AF5需16 μg/mL才达到同等效果。这种差异可能与AF4的C15链更易与真菌细胞膜胆固醇结合有关。#### 2.3 程序性细胞死亡通路解析

采用Annexin V-FITC/PI双染和TUNEL标记法，首次系统揭示了脂肽诱导真菌凋亡的分子机制：

- **PS外翻与膜通透性改变**：AF4在4 μg/mL时即引起C. glabrata 24%的早期凋亡（Q4区），而AF5需8 μg/mL才能达到同等效果。膜电位荧光检测显示，AF4处理组（8 μg/mL）的细胞膜电位降低至对照组的37%，提示脂肽通过形成跨膜孔洞（直径约5 nm）改变细胞内环境。

- **DNA损伤级联反应**：TUNEL染色显示，AF4在2×MIC（8 μg/mL）下使C. tropicalis的DNA断裂率达68%，且伴随ROS（还原型氧化三联素）水平升高3.2倍（通过DCFH-DA染色验证）。这与之前发现的AF4诱导真菌细胞周期停滞（G2/M期）的机制相吻合。

- **多阶段凋亡调控**：流式细胞术显示，AF4处理组C. glabrata的细胞死亡呈现典型四阶段凋亡谱：Q4（早期凋亡）占比从对照组的5%升至42%，Q2（晚期凋亡）达35%，Q1（坏死）仅占12%。这种阶段特异性死亡模式避免了传统化疗药物导致的细胞坏死（Q1>60%）。### 3. 临床转化潜力分析

#### 3.1 联合用药策略优化

研究首次建立抗生物膜药物联用模型：当AF4（8 μg/mL）与FLC（64 μg/mL）联用时，生物膜成熟度达72小时时仍保持93.1%的抑制率。这种协同作用源于：

- **物理屏障破坏**：AF4的疏水链可插入EPS脂质层，破坏其机械强度（SEM显示生物膜结构松散化）

- **代谢流阻断**：联合用药使C. tropicalis的磷酸戊糖途径关键酶（G6Pase）活性抑制达91%

- **耐药基因沉默**：qPCR检测显示CFTR1（氟康唑耐药基因）表达量在联用组降低至0.3拷贝/细胞，较单药组下降78%#### 3.2 智能递送系统开发

基于脂肽的 amphiphilic 特性（亲水头+疏水尾），研究团队提出新型递送方案：

- **自组装水凝胶**：AF4与AF5按1:1比例形成的两亲性复合物可自组装成纳米级（50-200 nm）水凝胶颗粒，其体外释放动力学显示24小时累积释放率达82%。

- **靶向渗透增强**：将脂肽负载于壳聚糖纳米颗粒（粒径300 nm），在C. glabrata生物膜模型中，药物渗透深度从对照组的12 μm提升至89 μm（激光共聚焦成像）。

- **长效缓释特性**：动物模型实验显示，水凝胶贴片在口腔念珠菌感染模型中持续释放活性成分达72小时，使黏膜表面生物膜覆盖率从78%降至9%。### 4. 机制创新点总结

（1）**跨膜作用新靶点**：AF4通过其C15链与真菌细胞膜中的ergosterol形成稳定复合物（结合常数Kd=0.8 μM），抑制膜脂过氧化酶活性达90%。

（2）**EPS合成关键酶抑制**：AF4/AF5可特异性抑制β-1,6-葡聚糖合成酶（Bis3p），使EPS聚合度从平均8.7降至2.3。

（3）**代谢-遗传双调控**：电镜显示AF4处理组细胞器膜结构异常（线粒体嵴缺失率61%），同时通过RNA测序发现HOG信号通路（Heme oxygenase-glycine oxidase）相关基因（CPS1、HO-1）表达下调2.3-4.1倍。### 5. 临床应用前景

该研究为侵袭性真菌感染治疗提供了三个突破方向：

1. **早期干预窗口**：实验证明在生物膜形成前2小时（0-4小时）使用AF4，可使24小时生物膜体积减少至对照组的8%

2. **耐药菌处理**：对氟康唑耐药C. auris的体外测试显示，AF4联合5-FC（氟胞嘧啶）可使 Minimum Inhibitory Concentration（MIC）从128 μg/mL降至4.2 μg/mL

3. **器械表面抗污染**：将AF4修饰到中心静脉导管表面涂层，在C. glabrata生物膜形成实验中，管壁生物膜负载量降低至0.3 CFU/mm2（对照组为12.7 CFU/mm2）### 6. 研究局限性及改进方向

当前研究存在三个主要局限：

- **动物模型局限**：现有数据主要基于体外模型，缺乏体内感染模型验证（如GFP标记AF4在小鼠系统性感染中的穿透率仅达38%）

- **长期毒性数据缺失**：脂肽的细胞膜损伤效应在48小时后可能逆转（SEM显示膜孔在72小时后闭合率41%）

- **混合菌群动态未完全解析**：C. tropicalis在AF4处理下会诱导C. glabrata进入耐受状态（代谢活性提升27%），需开发联合监测技术未来研究应着重构建三维生物膜模型（含细菌共生体），并开发基于脂肽自组装特性的智能响应药物载体。此外，针对真菌生物膜中普遍存在的铁依赖酶（如Ferric Uptake Regulator, FUR1），探索AF4/AF5的协同调控机制具有重要价值。