一种一体化光控CRISPR-Cas12b系统，结合环介导等温扩增技术，用于肺炎支原体的即时检测

《ACS Sensors》：One-Pot Photocontrolled CRISPR-Cas12b Coupled with Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Point-of-Care Test of Mycoplasma pneumonia

本研究通过NPOM修饰gRNA解决HOLMESv2系统因CRISPR过早切割导致的灵敏度低问题，光控激活后检测MP肺炎病原体灵敏度达133倍（7.5 copies/μL），结合手机读取器实现便携低成本诊断，临床样本检测显示99.0%敏感性和100.0%特异性。

　　

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）是一种广泛存在的呼吸道病原体，因此开发用于其检测的即时检测（POCT）方法至关重要。将环介导等温扩增（LAMP）技术与CRISPR-Cas12b系统结合使用，表现出显著的特异性，并为MP的POCT应用提供了广阔前景。然而，目前的一锅法LAMP/CRISPR-Cas12b系统（HOLMESv2）由于CRISPR对模板DNA的过早切割而存在灵敏度较低的问题，这限制了其实际应用效果。为了解决这一问题，本研究引入了一种光控的HOLMESv2（pHOLMESv2）检测方法，该方法使用经过NPOM修饰的间隔区。这种修饰可以阻止gRNA与MP DNA之间的完全碱基配对，从而使CRISPR-Cas12b系统在LAMP反应期间保持非活性状态，避免DNA模板的意外切割。LAMP反应完成后，光照可以去除gRNA上的NPOM基团，使其重新恢复切割LAMP产物的能力，从而产生荧光信号。pHOLMESv2成功解决了DNA模板过早切割的问题，将检测限（LoD）提高了133倍（达到7.5个拷贝/μL）。此外，该方法能够直接检测经过核酸释放剂处理的样本，无需复杂的提取步骤，并采用冻干试剂以提高稳定性、储存和运输性能。通过160份临床MP样本的检测验证，pHOLMESv2的灵敏度达到99.0%，特异性达到100.0%。当pHOLMESv2与开发的基于智能手机的扩增读取器结合使用时，可实现对MP的高度敏感、特异性强的便携式且经济高效的检测方法，显示出其在临床诊断中的巨大潜力。