单氨基和双氨基取代的斯夸拉米德衍生物的设计、合成及其生物学评价：作为强效抑制分枝杆菌三磷酸腺苷（ATP）合成酶的化合物

抗结核药物新候选分子基于邻二羰基酸 scaffold 的优化合成与活性研究，通过结构生物学分析 ATP 合成酶 F0 区域结合位点，开发了 31 种单/双氨基取代化合物。结果显示 PRP020 等衍生物对 Mtb 和 NTM 表现出微摩尔级抑制活性，较前代 SQ31f 和 SQ6ab 具有更优代谢稳定性（半衰期 >120 分钟）和低细胞毒性，且对 BDQ 耐药突变体仍有效。结构-活性关系表明丙二酰亚胺基团与 F0 环的苯并二氧嗪结构是关键，而哌嗪环替换为咪唑或噻唑可增强活性。同时证实 ATP 合成酶是 SQAs 的直接靶点，并发现 NTM 对 SQAs 存在固有耐药性。

　　

近年来，针对耐药结核分枝杆菌（Mtb）和难治性诺卡氏菌（NTM）的药物研发成为全球公共卫生领域的重点课题。传统抗结核药物因疗效不足、副作用显著及耐药性问题频发，亟需新型化学结构的药物突破。本文聚焦于一类基于squaric acid（SQA）骨架的化合物，通过结构优化和机制验证，展现出对耐药结核菌株和 NTM 的潜在活性，为抗结核药物研发提供了新方向。### 1. 研究背景与意义

结核病（TB）仍是全球致死率最高的传染病之一，2023年世界卫生组织（WHO）数据显示全球新增病例达820万例，死亡人数超过125万。尽管四联疗法（如 rifapentine、isoniazid等）可治愈85%的敏感结核病例，但多重耐药结核（MDR-TB）和广泛耐药结核（XDR-TB）的流行使治疗面临严峻挑战。此外，诺卡氏菌等环境致病菌引发的肺病治疗尤为困难，现有药物因毒性大、疗程长而难以突破。已批准药物 bedaquiline（BDQ）通过抑制Mtb ATP合成酶发挥疗效，但其快速耐药性（如Rv0678基因突变导致的泵出机制增强）和有限对NTM的活性，促使科研人员探索SQA类新化合物。SQA通过独特的化学结构靶向ATP合成酶的F?亚基，具有与BDQ不同的结合位点，可能规避耐药机制。### 2. 化学合成优化

研究团队采用简化的Friedel-Crafts缩合工艺，避免了传统AlCl?催化剂的环境风险。具体步骤包括：

- **二氯代SQA的制备**：以3,4-二羟基环丁烷-1,2-二酮为原料，经SOCl?处理生成二氯代中间体，产率达92%。

- **单氨基取代物的合成**：通过N-苯基吗啉与二氯代SQA在无溶剂条件下反应，产率从传统方法的16%提升至44%。关键创新点在于引入氨基甲酸酯结构，增强亲脂性并改善膜穿透能力。

- **二氨基取代物的拓展**：在单氨基骨架基础上，通过双氨基取代策略（如噻唑啉-5-甲胺基）构建更复杂的分子结构，其中PRP020的合成产率达85%，且纯度超过95%。### 3. 体外活性验证

#### 3.1 ATP合成酶抑制

通过烟曲霉（Msmeg）膜碎片酸化实验，筛选出31个SQA衍生物。其中：

- **PRP020**在1 μM浓度下即可完全抑制ATP合成酶（抑制率≥95%），较BDQ（MIC90=2 μM）活性相当，但对耐药突变株H37Rv_atpE_D28G的MIC值升至32 μM，显示一定交叉耐药性。

- **PRP017/021**等含噻唑环的衍生物，通过π-π堆积（与Phe69、Tyr68结合）和氢键（与Asn174、Glu65作用）双重机制增强抑制效果。#### 3.2 微生物活性测试

- **结核分枝杆菌**：PRP020对H37Rv野生株的MIC90为2 μM，较BDQ（MIC90=4 μM）更优；对耐药突变株（如atpE_A63P、Rv0678_Q51R）的MIC值仍保持在2-8 μM范围内。

- **诺卡氏菌**：PRP003（MIC90=1 μM）对Mabs（结核分枝杆菌 abscessus）和Mav（结核分枝杆菌 avium）展现显著活性，尤其对难以根除的Mabs肺病（无有效治疗方案）具有突破性意义。

- **耐药机制分析**：耐药突变株Rv0678_Q51R（R38stop）对PRP020的MIC值升高4倍，提示药物可能通过调控亚基构象发挥作用。### 4. 药代动力学与毒性评估

- **代谢稳定性**：PRP020在肝微粒体中的半衰期（t1/2>120分钟）显著优于前代药物SQ31f（t1/2=45分钟）和SQ6ab（t1/2=105分钟），其生物利用度提升3-5倍。

- **细胞毒性**：PRP020在J774A.1（小鼠单核细胞）和16HBE14σ（人支气管上皮细胞）中表现出剂量依赖性毒性，但IC50值（10 μM）远低于BDQ（IC50=0.5 μM），且1000 μM浓度下未观察到增殖抑制，安全性显著提高。

- **代谢途径研究**：通过比较含不同取代基的SQA在肝微粒体中的降解速率，发现苯并二氧杂环结构（如SQ6ab）易被CYP450酶代谢，而PRP020的甲氧基和噻唑环取代基可减少首过效应。### 5. 临床转化潜力

研究证实SQA类药物可通过以下策略突破现有治疗瓶颈：

1. **靶点创新**：除ATP合成酶外，PRP020还能协同其他药物（如clofazimine、tebipenem）通过多靶点抑制增强抗NTM活性。

2. **耐药性克服**：对BDQ耐药突变株（如atpE_D28G）仍保持活性，其作用机制可能涉及抑制质子回流而非单纯阻断ATP合成。

3. **剂型优化**：PRP020的溶解性（logP=2.1）和稳定性（t1/2>120分钟）使其更适合口服给药，动物实验显示其半衰期达8小时，生物利用度提升至35%。### 6. 局限性及未来方向

尽管取得突破，仍存在以下挑战：

- **NTM活性不足**：除PRP003外，多数SQA对Mav的MIC90>20 μM，需进一步优化疏水性或极性基团。

- **代谢转化研究**：需结合LC-MS/MS深度分析SQA在人体内的代谢途径，尤其是与CYP3A4、UGT1A1等酶的相互作用。

- **联合用药策略**：需验证PRP020与现有药物（如amikacin、rifabutin）的协同效应，特别是对XDR-TB和NTM混合感染的疗效。该研究为新型抗结核药物开发提供了重要参考，其核心价值在于：

1. 开发首个人源化友好的SQA候选药物（PRP020）

2. 验证ATP合成酶F?亚基作为治疗靶点的可行性

3. 建立耐药机制与结构-活性关系的定量模型未来研究可聚焦于：

- 基于冷冻电镜解析PRP020与ATP合成酶的分子互作

- 优化前药设计以改善脂溶性/水溶性平衡

- 开展跨物种毒性研究（如啮齿类与灵长类）