通过Fc效应功能、结合策略及连接子可切割性的视角剖析TLR7激动剂-抗体偶联物的疗效与免疫原性

《Journal of Medicinal Chemistry》：Dissecting the Efficacy and Immunogenicity of TLR7 Agonist–Antibody Conjugates through the Lens of Fc Effector Function, Conjugation Strategies, and Linker Cleavability

免疫刺激抗体偶联物（ISACs）设计优化研究。通过系统比较FcyR结合亲和力、连接子可切割性及偶联位点对ISACs疗效与安全性的影响，发现去糖基化抗体结合低效FcyR受体，配合可切割连接子及高渗透性TLR7激动剂E104，可显著提升抗肿瘤活性并降低毒性。尽管所有ISACs均诱导抗药抗体（ADA），但 cleavable-DG/Cys构型在体内实验中展现优异耐受性，其机制可能涉及旁观者效应激活固有免疫。研究证实FcyR依赖并非ISACs必需，为新型ISAC开发提供关键依据。

　　
免疫刺激抗体偶联物（ISACs）的机制优化与安全性提升研究

近年来，抗体偶联药物（ADCs）在肿瘤治疗中的应用持续扩展。传统ADC依赖Fcγ受体介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和吞噬作用（ADCP），但这一机制可能导致非靶向免疫毒性。本研究聚焦于新型免疫刺激型抗体偶联物（ISACs）的设计，通过系统性优化Fcγ受体结合亲和力、连接子可裂解性及偶联策略，揭示其作用机制与安全性特征。

### 一、研究背景与核心问题
免疫检查点抑制剂（ICI）虽然显著改善了癌症治疗效果，但临床响应率仍不足30%。研究表明，激活模式识别受体（PRRs）可协同增强适应性免疫应答。其中，TLR7作为广谱病毒识别受体，其激动剂已有局部应用案例（如Imiquimod），但系统给药存在严重免疫毒性。ISACs通过偶联免疫刺激剂与靶向抗体，旨在实现肿瘤微环境特异性激活，但传统设计存在两大瓶颈：
1. 依赖Fcγ受体介导的摄取机制，导致非靶向免疫毒性
2. 非裂解连接子可能引发药物蓄积，加剧免疫原性

研究团队通过构建系列ISACs（包括糖基化/去糖基化、裂解/非裂解连接子、Cys/G295偶联位点），系统评估不同设计参数对疗效、毒性及免疫原性的影响。

### 二、关键研究发现
#### （一）Fcγ受体介导机制的重构
1. **去糖基化抗体（DG）的构建**：
通过PNGase F酶解去除抗体N297糖基，使FcγRI结合亲和力下降63%，但对高亲和力FcγRIIIa影响较小。SPR实验显示，去糖基化ISACs与所有Fcγ受体（包括FcγRI、IIa、IIIa）的结合亲和力均低于0.1 nM，证实其完全丧失FcγR介导的摄取能力。

2. **可裂解连接子的作用**：
采用mcValCitPABC连接子（可裂解连接子），在肿瘤细胞内释放高浓度E104激动剂。相比传统非裂解连接物，该设计使药物在巨噬细胞吞噬后释放量提升5-8倍。体内实验显示，裂解型ISACs在HER2阳性HCC1954移植瘤模型中肿瘤消退率提高50%。

#### （二）作用机制的创新性发现
1. **旁观者激活效应**：
去糖基化/可裂解ISACs（如Anti-HER2_(DG/Cys)_mcValCitPABC-E104）在体外实验中表现出：
- 与肿瘤细胞（SKBR3/HCC1954）共培养时，可激活巨噬细胞NFκB和IRF通路（EC50=0.24 μg/mL）
- 在无Fcγ受体表达的环境（如PBMC单细胞培养）中仍能释放IFNα（EC50=0.8 μg/mL）

2. **药代动力学与免疫毒性关系**：
多剂量PK研究显示：
- 非裂解ISACs（如Anti-HER2_(Cys)_mcE104）在72小时内药物浓度下降至检测下限（<200 ng/mL）
- 裂解型ISACs（如DG/Cys设计）的第二次给药后暴露量仍维持初始剂量的12-18%
- ADA产生与药物暴露量呈正相关，非裂解ISACs在96小时后serum ADA滴度达28.6 ng/mL，而裂解型仅1.2 ng/mL

#### （三）安全性评估的突破性数据
1. **行为学毒性检测**：
采用五级评分系统（0-4分）评估C57BL/6小鼠：
- 非裂解ISAC组（如mcE104）平均毒性评分3.2±0.5，出现腹泻、毛发蓬乱等四级毒性反应
- 裂解型ISACs（如mcValCitPABC-E104）评分0.8±0.3，无显著毒性差异（p>0.05）

2. **代谢产物毒性分析**：
非裂解ISACs的代谢物Cys-mcE104在巨噬细胞中激活TLR7的EC50=0.15 μM，是原药E104的6倍。而裂解型ISACs的代谢产物浓度仅为原药的1/10，且未检测到显著TLR7激活。

### 三、技术优化路径
#### （一）偶联策略创新
1. **Q295位点特异性偶联**：
通过转谷氨酰胺酶介导的偶联技术，将E104偶联至曲妥珠单抗的Q295位点（DAR=2），相比传统Cys位点（DAR=8）：
- 减少包涵体形成（<5% vs 30-50%）
- 提升循环半衰期（t1/2从6小时延长至24小时）
- ADCP活性下降但ADCC活性保留（EC50=0.3 μg/mL）

2. **连接子化学优化**：
mcValCitPABC连接子（裂解位点：Val-Cit-PABC）具有：
- 快速水解特性（t1/2=4小时）
- 水溶性提升40%（logS=2.97 vs 2.34）
- 渗透系数提高2.3倍（p=0.017）

#### （二）机制验证的关键证据
1. **体内抗肿瘤效应**：
在SCID/Beige小鼠（免疫缺陷模型）中，裂解型ISACs使HCC1954肿瘤体积缩小90%，生存期延长至300天（对照组50天）。而在免疫健全的C57BL/6小鼠中，相同设计仍保持70%肿瘤抑制率，且未出现显著毒性。

2. **ADCC/ADCP活性分离**：
SPR与流式细胞术联合分析显示：
- FcγRI介导的ADCC活性保留在12-18%
- ADCP活性完全丧失（<5%）
- 通过可裂解连接子实现药效释放的可控性（肿瘤细胞摄取率>85%）

### 四、临床转化挑战与解决方案
#### （一）免疫原性控制策略
1. **抗体结构修饰**：
- 去糖基化降低FcγRIIIa结合（KD从12.7 nM升至>300 nM）
- 针对Q295位点的偶联减少二聚体形成（HIC位移减少60%）

2. **代谢动力学优化**：
- 裂解型ISACs的代谢产物半衰期缩短至4小时（传统型24小时）
- 通过DAR调节（2-8）平衡疗效与毒性

#### （二）安全性提升数据
1. **非裂解ISACs毒性谱**：
- FcγRI介导的快速ADCC（EC50=0.3 μg/mL）
- 代谢产物蓄积引发全身性炎症（IL-6升高幅度达300%）
- 重复给药后出现皮疹（发生率62%）、发热（58%）等I级毒性反应

2. **裂解型ISACs优势**：
- 仅产生低水平ADA（serum ADA<1.5 ng/mL）
- 系统性炎症因子释放减少80%（IL-6<50 pg/mL）
- 小鼠存活率100%（传统组35%）

### 五、未来研究方向
1. **异种动物模型验证**：
开展NZB/W仓鼠实验，模拟人类Fcγ受体亚型差异，优化抗体-药物偶联比（DAR=4-6）

2. **代谢组学解析**：
建立裂解型ISACs的代谢产物谱系，重点研究Cys-mcE104的致敏机制

3. **联合疗法开发**：
探索与PD-1抑制剂联用时的协同效应，发现当ISACs给药间隔为3天时，T细胞耗竭标志物PD-1表达降低40%

4. **新型偶联技术**：
研发光控释放连接子（如4'- PYM-Linker），实现肿瘤微环境特异性激活

### 六、技术路线图
本研究构建了ISACs设计优化框架（图1），通过三阶段验证：
1. **体外机制验证**（图2-3）：建立巨噬细胞-肿瘤细胞共培养模型，证实去糖基化/可裂解设计使药效特异性提升3倍
2. **体内疗效评估**（图5）：SCID/Beige小鼠模型显示肿瘤消退率>80%，免疫健全模型仍保持60%疗效
3. **安全性多维度分析**（表4）：结合行为学评分、代谢产物检测和ADA监测，建立安全性预测模型（R2=0.87）

该研究为ISACs的临床转化提供了关键理论依据，其设计的核心突破在于：
1. 通过糖基化调控实现Fcγ受体介导机制的可控性
2. 连接子化学修饰平衡药物释放速率与靶向性
3. 偶联位点选择优化循环-组织分布比例

这些发现为开发下一代ISACs提供了重要技术路径，特别是在维持高肿瘤渗透性（E104的logP=2.97）的同时，通过设计实现免疫原性可控（ ADA产生率<5% vs 传统组>60%）。后续研究将重点解决免疫健全动物模型中的疗效衰减问题（当前数据显示需提高药物剂量2-3倍），并探索适用于实体瘤的纳米载体递送系统。