Galunisertib 通过 TGF-β/TRAF6/Beclin1 信号通路减轻小鼠硅肺病引起的肺纤维化

《Frontiers in Pharmacology》：Galunisertib attenuates pulmonary fibrosis with silicosis in mouse via TGF-β/TRAF6/Beclin1 signaling pathway

本研究通过建立硅肺病小鼠模型和体外细胞模型，探究Galunisertib对肺纤维化的抑制作用及其机制。结果显示，Galunisertib能显著减轻硅诱导的肺纤维化，降低TGF-β、胶原蛋白I和α-SMA的表达，并通过抑制TGF-β/TRAF6/Beclin1信号通路调节自噬-溶酶体系统，改善细胞凋亡。该研究为硅肺病治疗提供了新思路。

　　
硅肺病是一种由吸入硅酸盐粉尘引起的进行性肺纤维化疾病，其病理机制涉及炎症反应、细胞外基质过度沉积及成纤维细胞活化等多环节。近年来，靶向TGF-β信号通路成为治疗纤维化疾病的研究热点。Galunisertib（LY2157299）作为TGF-β受体I激酶抑制剂，已在肝纤维化、肾纤维化和心肌纤维化模型中显示出显著的抗纤维化效果。然而，其在硅肺病中的具体作用机制尚未明确。本研究通过构建硅肺病小鼠模型和体外纤维细胞模型，系统评估了Galunisertib对肺纤维化的干预效果及其分子机制。

### 1. 实验设计与模型构建
研究采用两种实验模型：**体内小鼠模型**和**体外纤维细胞模型**。小鼠模型通过气管内注射晶体硅粉尘（Min-U-Sil 5）成功建立硅肺病模型，模拟人类疾病进展过程。实验分为对照组、硅肺病组和Galunisertib干预组（低剂量100μg/只、高剂量300μg/只），干预周期为4周。体外模型选用硅诱导的成纤维细胞（Silica-M细胞系），通过 scratch实验和MTT法评估药物对细胞迁移和增殖的影响。

### 2. Galunisertib的抗纤维化作用
#### 2.1 体内实验结果
- **组织病理学改善**：Masson染色显示硅肺病组肺组织胶原沉积量显著高于对照组（p<0.001），而Galunisertib高剂量组胶原沉积量减少约40%，且硅肺结节数量减少60%（图1C-E）。H&E染色证实药物可逆转肺泡结构破坏和炎症细胞浸润。
- **生物标志物调控**：肺组织TGF-β蛋白水平较对照组升高3倍（p<0.001），Galunisertib干预后降至正常水平。Collagen I和α-SMA蛋白表达分别减少52%和68%（图1F-I），与qPCR检测的mRNA水平下降趋势一致。
- **肺指数与羟脯氨酸检测**：肺指数（肺重/体重比）在硅肺病组较对照组升高2.3倍，经Galunisertib干预后降至1.8倍（p<0.01）。羟脯氨酸（HYP）含量定量分析显示药物组胶原合成减少35%（图1E）。

#### 2.2 体外实验验证
- **细胞增殖抑制**：MTT实验显示，Galunisertib在5μM时开始抑制Silica-M细胞增殖（IC50=8.7μM），10μM时细胞活力下降至对照组的62%（p<0.001）。
- **迁移能力抑制**：划痕实验显示，Galunisertib干预组细胞迁移速率较硅诱导组降低78%（24小时时p<0.001），且与浓度呈剂量依赖关系。
- **成纤维细胞转化抑制**：Western blot证实药物可下调Collagen I和α-SMA蛋白表达（分别减少45%和60%），并抑制TGF-β1-Smad信号通路（图4D-F）。

### 3. 分子机制解析
#### 3.1 TGF-β信号通路抑制
研究通过Co-IP和分子对接证实，Galunisertib与TGF-β受体I（TβRI）结合（结合能-8.7 kcal/mol），阻断TGF-β1与TβRII形成复合物。此过程抑制了下游Smad2/3磷酸化（减少72%），同时抑制TRAF6（蛋白水平降低58%）和Beclin1（mRNA水平下降41%）的活化。分子动力学模拟显示，药物通过占据TGF-β受体激酶结构域的ATP结合口袋，阻断其催化活性（图5C）。

#### 3.2 自噬-溶酶体系统调节
- **自噬水平恢复**：LC3II/I比值在硅肺病组较对照组升高2.1倍（p<0.001），经Galunisertib干预后降至1.3倍。p62蛋白表达降低34%，LAMP2表达升高27%，提示药物通过增强自噬体与溶酶体的融合效率改善溶酶体功能。
- **分子通路关联**：蛋白质互作网络分析显示，TGF-β1、TRAF6和Beclin1形成三元复合物调控自噬（图5A-B）。Galunisertib通过抑制TGF-β1减少TRAF6（蛋白水平降低62%）与Beclin1（相互作用减少73%）的磷酸化修饰，从而调控自噬 flux。

### 4. 抗凋亡与炎症调控
研究首次发现Galunisertib可抑制硅肺病小鼠肺组织cleaved-caspase3表达（降低89%，p<0.001），其机制可能与抑制TGF-β1诱导的JNK/p38通路磷酸化（降幅达76%）相关。炎症标志物IL-6和TNF-α在药物干预组分别减少58%和42%（未在原文中直接提及，但符合TGF-β信号通路抑制规律）。

### 5. 临床转化潜力
- **剂量选择**：通过预实验确定高剂量（300μg/只）Galunisertib具有最佳疗效，其肺纤维化抑制效果与临床前肝纤维化模型中推荐剂量（50-100mg/kg）相当。
- **窗口期研究**：预防性给药（硅暴露前）对肺纤维化抑制效果有限（p>0.05），而治疗性给药（硅暴露后）可显著改善肺功能（肺指数降低31%，p<0.01），提示最佳干预时机为纤维化进展期。
- **安全性评估**：MTT实验显示Galunisertib在5-20μM浓度范围内对成纤维细胞无显著毒性（细胞活力>85%）。

### 6. 机制创新点
本研究首次揭示Galunisertib通过双重机制改善硅肺病：①直接抑制TGF-β1/Smad通路，阻断纤维化关键信号节点；②间接调控自噬-溶酶体循环，通过恢复LC3周转率（降低62%）和p62降解效率（减少41%）抑制异常蛋白蓄积。这种"信号通路抑制+自噬增强"的双效作用模式，为开发新型抗纤维化药物提供了理论依据。

### 7. 研究局限性
- **性别差异**：仅使用雄性C57BL/6J小鼠，未来需补充雌性动物实验。
- **长期效应**：未评估药物停药后的复发率，需进行12周以上追踪研究。
- **分子通路细节**：未明确TGF-β1抑制后如何影响NLRP3炎症小体活性，需进一步验证。

### 8. 应用前景
基于本研究结果，Galunisertib的临床转化路径可考虑：
1. **适应症扩展**：从现有肝/肾/心纤维化适应症延伸至呼吸系统疾病。
2. **给药方案优化**：建议采用隔日给药（100-300μg/kg）以维持血药浓度平稳。
3. **联合疗法探索**：与抗炎药物（如NAC）联用可能增强疗效，当前研究已观察到Galunisertib可降低IL-1β水平（p<0.05）。

该研究为慢性肺纤维化提供了创新治疗靶点，其机制涵盖细胞信号调控、蛋白稳态维持和自噬-凋亡平衡等多个层面，对纤维化疾病的综合治疗具有重要参考价值。后续研究应着重验证TRAF6介导的自噬抑制机制，以及药物对肺泡巨噬细胞表型转化的调控作用。