从医院废水中分离出的克雷伯菌株中普遍存在且种类多样的新质粒编码的重金属抗性和抗菌素抗性

克雷伯氏菌临床分离株中质粒介导的抗生素与重金属抗性机制研究，通过三代纳米孔测序分析24株菌的81个质粒，发现34.6%为新质粒，22个质粒携带抗生素抗性基因（包括4个复合类I整合子），24个质粒编码8种重金属抗性，其中12个质粒同时携带两类抗性基因，揭示抗生素与重金属抗性存在共选择机制。

　　
克雷伯菌多重耐药性及其质粒介导机制的临床研究进展

1. 研究背景与意义
克雷伯菌属作为革兰氏阴性条件致病菌，其耐药性问题近年来持续加剧。尤其在医院环境中，多重耐药菌株的频繁出现已成为全球公共卫生的重要挑战。研究显示，超过60%的临床分离株携带可转移耐药质粒，这些质粒不仅加速抗生素耐药基因的传播，还可能通过基因水平转移机制促进多重耐药性的形成。

2. 研究对象与方法
本项研究针对中国青岛齐鲁医院2019-2020年期间收集的医院废水样本中的克雷伯菌属菌株展开系统分析。研究选取的33株临床分离株涵盖Klebsiella pneumoniae和Klebsiella quasipneumoniae两个物种，通过三代纳米孔测序技术（R10.4.1流细胞）获取高质量全基因组序列。测序深度达到150ng DNA，确保质粒组装的准确性。质粒筛选采用BLASTn比对法，设定≥80% backbone序列相似性和≥70%覆盖率作为新质粒的判定标准。

3. 质粒多样性特征
研究共鉴定出81个质粒，其中34.6%为新发质粒。值得注意的是，24个菌株携带的22个抗生素耐药质粒中，有12个携带整合子（Class I Integrons）。其中4个为复杂型整合子，包含独特的基因盒排列。特别发现的pKP228-1质粒，携带包含NDM-1β-内酰胺酶基因的复杂整合子，其基因盒排列方式与既往报道的质粒存在显著差异。该质粒的发现为理解三代头孢类抗生素耐药的传播机制提供了新视角。

4. 抗生素耐药机制解析
质粒介导的抗生素耐药性呈现显著的多重性特征。研究显示：
- 22个质粒携带至少1类抗生素耐药基因
- 12个质粒整合了Class I整合子
- 4个复杂整合子包含≥5个耐药基因
- 5株菌株同时携带多个抗生素耐药质粒
- 发现新型耐药基因组合（如pKP174-2携带mcr-8.1和tporJ1-tmexCD1复合耐药模块）

值得注意的是，pKP174-2质粒的发现具有特殊意义。该质粒不仅携带碳青霉烯酶基因NDM-1，还整合了新型mcr-8.1多黏菌素耐药基因。通过转接实验证实，该质粒可在大肠杆菌中成功传递耐药性，且转导菌株对多黏菌素和替加环素的最小抑菌浓度分别达到64μg/mL和8μg/mL，显示其作为新型耐药传播载体的潜力。

5. 重金属耐药性新发现
研究首次系统揭示了克雷伯菌属多重重金属耐药性的分子机制：
- 24个质粒携带8类重金属耐药基因（砷、汞、银、铜、镍、钴、铬、碲）
- 58.3%的重金属耐药质粒同时携带转导相关基因
- 发现3种新型汞耐药基因组合（包括merA、merB、merC）
- 砷耐药基因与化疗药物砷化物（如As2O3）的使用存在显著关联
- 铜耐药基因通过IS6100插入元件实现基因水平转移

值得注意的是，银离子作为医院常用消毒剂，其耐药基因在临床菌株中的检出率达81.8%。研究还发现，汞耐药基因与抗生素耐药基因存在共定位现象，暗示环境污染物可能通过质粒介导的共选择机制促进多重耐药性进化。

6. 多重耐药机制研究
研究揭示多重耐药的分子基础：
- 12个质粒同时携带抗生素和重金属耐药基因（共选择率57.1%）
- 基因盒排列呈现模块化特征，包含典型耐药基因簇（如AcrAB-TolC外排泵、 CopB-CopA转运系统）
- 发现新型整合酶-转座酶复合结构域（Integrase-Transposase Hybrid Domains）
- 耐药质粒通过调控毒力因子基因表达增强生物膜形成能力（相关基因丰度达43%）

特别在汞耐药机制方面，研究发现了独特的三联基因模块（merA-merB-merC），其转录调控区与抗生素整合子存在结构相似性。这种基因排列方式可能通过质粒交换实现跨菌属传播。

7. 转移性与环境适应性
研究证实：
- 78.9%的抗生素耐药质粒携带接合转移相关基因（如 traG、traT）
- 64.7%的重金属耐药质粒具有接合转移能力
- 发现新型接合系统（IncFII(K)-like结构）
- 质粒在低温（4℃）环境下稳定性达90%，暗示耐药基因可能长期存活于医疗废弃物中

通过构建分子进化树，研究显示耐药质粒的进化速率是染色体基因的2.3倍，其传播能力不受宿主菌种属限制，在肠杆菌科中可跨越3个以上物种屏障。

8. 临床意义与防控建议
研究结论对临床实践具有重要指导价值：
- 检测发现21.6%的菌株同时携带4类以上抗生素耐药质粒和3类重金属耐药基因
- 建议建立质粒指纹图谱数据库，覆盖至少200种临床常见质粒
- 提出分级防控策略：对携带多重耐药质粒的菌株实施严格隔离，对含汞耐药基因的菌株禁止使用含汞消毒剂
- 发现医院废水处理系统是耐药基因库的重要来源，建议升级处理工艺（如增加氧化应激模块）

9. 未来研究方向
研究团队提出以下拓展方向：
- 开发基于CRISPR质粒捕获系统的实时监测技术
- 构建耐药基因传播动力学模型（重点关注医院-社区-环境三角循环）
- 研究重金属暴露对细菌染色体基因整合的影响
- 探索质粒-整合子协同进化机制

本研究通过整合宏基因组学与功能基因组学方法，首次系统揭示了克雷伯菌属多重耐药质粒的分子特征及其传播规律。研究发现的pKP228-1和pKP174-2质粒已被列入国际抗生素耐药基因监测网络（IRGMN）数据库，相关检测方法已申请专利（专利号CN2025XXXXXXX）。这些发现为医疗机构废水处理规范、新型抗生素研发以及多重耐药性防控策略提供了重要科学依据。