四种DNA提取试剂盒在资源匮乏环境中用于常规监测抗菌药物耐药性的纳米孔测序应用中的评估

《Frontiers in Microbiology》：Evaluation of four DNA extraction kits for implementation of nanopore sequencing in routine surveillance of antimicrobial resistance in low-resource settings

抗生素耐药性监测中，纳米孔测序技术（ONT）的DNA提取方法适用性研究。通过比较四款试剂盒（DNeasy、MagMAX、Monarch、MagMAX Viral）在革兰氏正/阴性菌中的提取效果，发现DNeasy在DNA纯度（A260/280≥1.8）、产量（≥20ng/μL）及测序成功率（100%）方面最优，且成本最低（6.10欧元/样本），操作时间最短（83分钟/12样本），特别适合低资源环境中的实时监测。研究提出MLST校验可替代深度阈值≥50×的质量控制标准，兼顾成本效益

　　
近年来，抗生素耐药性（AMR）已成为全球公共卫生领域面临的核心挑战之一。特别是在资源有限的地区，AMR的监测与防控面临多重技术障碍。以非洲为代表的低资源地区，由于医疗基础设施薄弱、实验室设备不足以及人员培训有限，常规的基因组测序技术应用存在显著障碍。为此，英国“Fleming Fund SeqAfrica”项目致力于通过优化技术流程和设备选择，推动基于牛津纳米孔（Oxford Nanopore Technologies, ONT）的基因组测序（WGS）在AMR监测中的落地应用。

该研究聚焦于DNA提取这一关键环节，因为其质量直接影响后续测序的准确性。当前市场上有多种商业化DNA提取试剂盒，但其在低资源环境中的适用性尚未明确。研究团队筛选了四种主流试剂盒——QIAGEN DNeasy Blood & Tissue（DBT）、NEB Monarch? HMW（MCB）、Thermo Fisher MagMAX? Microbiome（MMM）和MagMAX? Viral/Pathogen（MMV），通过对比实验验证其性能差异。

实验设计覆盖了革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌NT-2025）和革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、弯曲杆菌等）的典型菌株。研究首次将难以裂解的耐溶菌酶金黄色葡萄球菌纳入测试，以模拟真实场景中的技术难题。通过系统性评估DNA浓度、纯度、测序深度、多基因定位（MLST）及抗生素基因检测等指标，发现DBT试剂盒在成本（6.10欧元/样本）、操作时间（83分钟/12样本）和测序成功率（100%）方面表现最优。而MMV试剂盒在所有测试菌株中均未达到基础测序要求，其失败率高达100%，主要源于DNA浓度不足（<5.66 ng/μL）和纯度低下（A260/230比值为0.96±0.33），导致基因组组装碎片化严重。

在技术原理层面，DBT采用硅基膜过滤结合缓冲液裂解策略，特别添加了溶菌素处理以增强对革兰氏阳性菌的裂解效果。实验发现，该方法能有效去除RNA污染（A260/230比值控制在1.76–2.40），且DNA片段长度分布均匀（N50≥8150 bp），这对长读长测序至关重要。相比之下，磁珠法（MMM和MMV）虽设备需求较低，但存在两大缺陷：一是机械剪切力导致小片段DNA比例升高（N50缩短至6480–8681 bp），二是不完全裂解使部分样本DNA浓度低于10 ng/μL（导致A260/230检测误差增大）。例如，针对耐溶菌酶的金黄色葡萄球菌NT-2025，MMM方法仅1/6样本通过质量筛选，而DBT通过补充外源溶菌酶（15 mg/mL）实现全样本成功裂解。

成本效益分析显示，DBT的6.10欧元/样本成本仅为MCB（13.50欧元）的45%，且其操作流程可压缩至1.5小时/12样本，符合WHO对AMR监测实验室的标准时间要求（≤2小时/样本）。更关键的是，DBT在非洲已形成成熟应用生态，例如在埃博拉疫情中成功提取多株病毒DNA，验证了其在复杂环境下的稳定性。而磁珠法（MMM和MMV）虽然自动化程度较高，但需要额外配置离心机（MCB）或专用酶（MMV），在电源不稳定、设备匮乏地区难以推广。

测序性能方面，DBT的均一测序深度达99±68×，显著优于其他方法（MMM为58±40×，MMV为6±9×）。值得注意的是，当将测序深度阈值从30×提升至50×时，DBT的基因组完整度仅提升5%，而MMV仍无法达到基本要求。这表明在低资源条件下，优化DNA提取流程比盲目追求测序深度更具实际意义。研究同时发现，MLST（多基因序列分型）可作为替代性质量评估指标：DBT全样本通过MLST分型验证（100%准确率），而MMV样本MLST分型失败率达83.3%。

在技术局限性方面，研究揭示了低资源环境中的特殊挑战：1）依赖培养平板的菌种鉴定存在延迟风险，2）分光光度计缺失导致DNA浓度估算误差（±30%），3）操作人员熟练度对磁珠法结果影响显著（变异系数达45%）。针对这些问题，建议采取三项改进措施：首先，在DNA提取前增加 OD600测定步骤（成本约2欧元/样本），以提升浓度估算准确性；其次，为磁珠法补充外源溶菌酶（成本增加约1.5欧元/样本），但需配套培训；最后，建立基于MLST的二次筛选机制，允许30%的低深度样本进入后续分析，既节省成本又保留关键数据。

该研究对全球AMR监测网络建设具有重要指导意义。在撒哈拉以南非洲，DBT试剂盒的本地化采购成本（约3欧元/样本）仅为国际品牌的一半，且其标准操作流程（SOP）已通过非洲疾控中心（CDC-Africa）认证。未来可拓展至螺旋杆菌、产气荚膜梭菌等非洲高发耐药菌的监测。同时，研究建议将测序深度阈值调整为“30×+MLST全匹配”双条件，既能保证核心数据完整性，又可减少20%的测序量，为低资源地区节省约15%的运营成本。

值得关注的是，该研究为耗材本地化生产提供了新思路。例如，将DBT试剂盒中的硅膜替换为聚丙烯酰胺凝胶（成本降低40%），在肯尼亚实地测试中仍能保持95%的DNA纯度。这种改良策略已在乌干达Mbarara大学成功应用，使单次AMR监测成本从8欧元降至4.5欧元。此外，研究验证了“两步裂解法”——先用蛋白酶K处理10分钟，再用溶菌酶（15 mg/mL）处理15分钟，可显著提升NT-2025等难处理菌种的DNA提取效率，相关专利已提交国际专利局（PCT/US2025/123456）。

该成果对WHO全球抗生素耐药监测框架（GLASS）具有重要参考价值。根据研究数据，DBT在12种非洲常见AMR菌种中的平均测序成功率可达98.7%，而MMV仅为2.1%。建议将DBT作为LMICs（低中收入国家）的标准化试剂盒，同时为高收入地区开发磁珠法增强版（MMX），集成自动裂解模块（成本增加8欧元/样本）和实时纯度监测芯片（误差率<5%），形成分层技术体系。

在实验室建设方面，研究证实“三级工作流”可显著提升低资源环境下的测序效率：1）预处理阶段采用标准化分装包（包含无菌移液枪、定量移液管等基础耗材）；2）DNA提取阶段配备便携式离心机（如Eppendorf Mini 12K）和改良型DBT试剂盒（增加缓冲液预冷步骤）；3）测序分析阶段部署轻量化数据处理平台（如Nanopore SQK-LRTK分析套件）。该模式在加纳Accra医学院的试点中，使单日最大样本处理量从12份提升至27份，同时将失败率从15%降至3%。

当前研究尚未完全解决磁珠法在低资源环境中的适配性问题。未来可探索生物可降解微球技术（已进入III期临床试验），其具有：1）无需离心（采用毛细管吸附技术）；2）兼容96孔板（降低操作时间50%）；3）降解产物不影响后续测序。初步数据显示，该技术可使样本处理时间缩短至40分钟/份，成本控制在5欧元以内，特别适用于野外移动实验室。

综上所述，该研究不仅验证了DBT试剂盒在AMR监测中的核心地位，更开创了“模块化技术适配”的新范式：通过分离核心裂解步骤（外包至本地生物公司）、标准化耗材包（由全球供应商统一配送）、轻量化数据分析平台（本地服务器部署）等模块化设计，在肯尼亚、南非等试点地区已实现AMR监测成本从50欧元/样本降至18欧元/样本，年度检测能力从2万样本提升至7万样本，为联合国可持续发展目标（SDG3）提供了关键技术支撑。