Treg相关基因标签预测皮肤黑色素瘤预后及免疫抑制的新机制

《Clinical and Experimental Medicine》：Identification of a Treg-related gene signature for predicting prognosis and immunosuppression in skin cutaneous melanoma

本研究针对皮肤黑色素瘤(SKCM)中调节性T细胞(Tregs)驱动的免疫抑制微环境导致预后差的问题，通过整合生物信息学与实验验证，构建了基于10个Treg相关基因(PTPRF、ULK1、TGM3、CRABP2、SV2A、HLA-DQB2、KHDRBS3、VWA5A、CRIP1、TFAP2C)的预后标签。该标签能有效预测SKCM患者总生存期，发现高风险患者富集于角化通路，低风险患者激活自身免疫和感染相关通路，并预测了54种靶向药物。研究为SKCM的预后评估和个性化免疫治疗提供了新生物标志物和策略。

　　

在阳光灿烂的日子里，我们享受着紫外线带来的温暖，却也可能在不经意间埋下健康的隐患。皮肤黑色素瘤(SKCM)这种起源于黑色素细胞的高度侵袭性恶性肿瘤，虽然发病率相对其他皮肤癌较低，却造成了75-90%的皮肤癌相关死亡。根据GLOBOCAN 2020报告，全球每年约有32.5万新发SKCM病例和5.7万死亡病例，预计到2040年将上升至51万病例和9.6万死亡病例。

早期SKCM通常可以通过手术切除有效治疗，然而晚期和转移性黑色素瘤的治疗仍然充满挑战，5年总生存率仅为10-29%。当前，免疫检查点抑制剂(ICI)和过继性细胞免疫治疗是SKCM免疫治疗的核心策略。PD-1/PD-L1抑制剂通过阻断PD-1/PD-L1轴恢复T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，而CTLA-4抑制剂通过激活T细胞的初始免疫反应增强抗肿瘤应答。然而，这些疗法存在明显局限性：仅约40-60%患者显示有效反应，部分产生原发性或继发性耐药；免疫相关不良事件常见；过继性细胞免疫治疗受制于复杂的制备过程和高成本。

在这一复杂的治疗困境中，调节性T细胞(Tregs)及其介导的治疗耐药机制尤为关键。Tregs作为肿瘤微环境中的关键免疫抑制细胞亚群，通过分泌IL-10和TGF-β等抑制性细胞因子、消耗IL-2、表达CTLA-4和PD-1等免疫检查点分子，协调免疫抑制活动，不仅促进肿瘤进展和转移，还导致对免疫检查点抑制剂的治疗抵抗。因此，识别Treg相关分子生物标志物对优化SKCM的预后评估和治疗策略具有重要意义。

研究人员从公共数据库获取SKCM相关数据集，运用加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选与Tregs相关的基因模块，与差异表达基因相交获得Treg-DEGs。通过单变量Cox比例风险回归、LASSO回归和多变量Cox比例风险回归构建预后生物标志物标签。整合功能富集分析、分子调控网络构建和药物预测分析探索预后生物标志物的生物学功能。最后通过qRT-PCR和Western blot在细胞实验中验证生物标志物的mRNA和蛋白表达水平。研究队列包括来自TCGA的458个SKCM样本和来自GEO的GSE46517(104个SKCM和7个正常皮肤样本)、GSE65904(210个SKCM患者)数据集。

Tregs在SKCM中可能发挥关键作用

分析GSE46517数据集中SKCM与正常样本的差异表达基因，共获得1117个DEGs，包括409个上调和708个下调基因。免疫浸润分析显示，SKCM与正常样本间9种免疫细胞存在显著差异，其中Tregs在SKCM中显著富集，表明Tregs在SKCM免疫微环境中扮演重要角色。

基于WGCNA识别Tregs-DEGs

通过WGCNA分析，设定软阈值为5(R²=0.906)，鉴定出13个共表达模块。选择与Tregs含量最相关的模块作为关键模块，获得2306个Tregs模块基因。与SKCM组和对照组间的1117个DEGs重叠，获得753个Tregs-DEGs。这些基因在生物学过程(BP)中富集于表皮发育、皮肤发育、细胞外结构组织等过程，KEGG通路分析显示主要富集于醛固酮调节的钠重吸收、ECM-受体相互作用、补体和凝血级联等通路。STRING蛋白互作网络显示EGFR与其他蛋白质相互作用密切。

Tregs相关风险模型良好预测SKCM预后

基于753个Tregs-DEGs进行单变量COX比例风险回归分析，获得160个预后相关基因。LASSO回归分析筛选出22个特征基因，最终通过多变量COX回归确定10个预后生物标志物：PTPRF、ULK1、TGM3、CRABP2、SV2A、HLA-DQB2、KHDRBS3、VWA5A、CRIP1和TFAP2C。构建的风险模型在训练集和验证集中均显示良好预测性能，1年、3年和5年ROC曲线下面积(AUC)均大于0.6。Kaplan-Meier生存曲线显示高风险组预后较差。

Treg相关基因标签的实验验证

在黑色素瘤细胞系(A375、SK-MEL-28、SK-MEL-5)和正常角质形成细胞系HaCaT中验证所选基因的mRNA和蛋白表达。高风险基因CRABP2、ULK1和TGM3在mRNA和蛋白水平均显著上调。PTPRF mRNA在SK-MEL-5中与HaCaT相比无统计学意义，但蛋白水平在所有黑色素瘤系中均显著升高。保护性基因SV2A、HLA-DQB2、VWA5A、CRIP1、KHDRBS3和TFAP2C在转录水平普遍下调。

SKCM中的独立预后因素

单变量COX分析显示风险评分、病理T分期、N分期、年龄、Clark水平、Breslow深度和肿瘤分期与SKCM预后相关。多变量COX分析确定风险评分、年龄、病理T分期和N分期为独立预后因素。构建的列线图可根据各临床因素的总分预测1年、3年和5年生存率，校准曲线显示风险模型具有良好有效性。分层生存分析显示，不同临床特征的SKCM患者生存差异显著，高风险患者预后更差。

Tregs相关风险模型与免疫应答通路相关

基因集富集分析(GSEA)显示，高风险组与角化相关，低风险组富集于自身免疫和感染相关通路。免疫应答基因集活性分析显示，高风险组和低风险组在干扰素、白细胞介素、TGFb家族成员等通路活性存在显著差异。Spearman相关分析显示预后基因与免疫应答基因组呈负相关，其中HLA-DQB2与抗原加工和呈递相关性最高(r=0.78)，CRIP1与TNF家族成员受体相关性为0.77。

ceRNA调控网络和药物预测

构建的ceRNA网络包含74个节点和211条边，包括8个Treg相关mRNA、42个miRNA和24个lncRNA。研究发现24个lncRNA通过调控miRNA与8个mRNA之间的42个序列关系，在活跃SKCM中通过调节PTPRF、ULK1、CRABP2、HLA-DQB2、SV2A、KHDRBS3、VWA5A和TFAP2C的表达发挥关键作用。药物预测分析鉴定出54种潜在药物，其中ULK1预测24种药物，其他9个基因预测40种药物。SV2A表达可能受白藜芦醇、甲硝唑等影响。

这项研究通过整合生物信息学分析和实验验证，揭示了SKCM中一种新的Treg相关基因特征，该特征通过关键代谢和信号通路驱动免疫抑制。这10个基因在调节黑色素瘤免疫抑制微环境中通过互补机制发挥作用，包括抗原呈递调节、代谢重编程和转录调控。从抗原呈递和免疫调节层面，HLA-DQB2作为MHC II类分子的β链直接参与肿瘤抗原呈递，其异常表达可能通过影响抗原呈递效率调节Treg激活和招募。PTPRF作为受体型蛋白酪氨酸磷酸酶，是T细胞受体信号传导的负调节因子，其功能障碍与多种恶性肿瘤中免疫抑制微环境的形成相关。

在代谢重编程方面，ULK1作为启动自噬的关键激酶，在肿瘤微环境的代谢应激下增强Treg自噬活性，从而维持其抑制功能和存活。CRABP2参与视黄酸信号通路，视黄酸是调节Treg分化和功能的关键代谢分子，其异常表达可能通过调节视黄酸代谢影响黑色素瘤中Treg介导的免疫抑制。在转录调控层面，TFAP2C作为AP-2转录因子家族成员，不仅在黑色素瘤细胞增殖和侵袭中起重要作用，还可能调节免疫相关基因的转录。KHDRBS3参与mRNA剪接和稳定性，可能通过转录后机制调节肿瘤微环境中免疫相关基因的表达。

转谷氨酰胺酶3(TGM3)属于钙(Ca²⁺)依赖性酶类，能够催化蛋白质交联。研究表明TGM3在皮肤基底细胞癌中表达，并通过PI3K-AKT信号通路介导角蛋白14降解来调节皮肤鳞状细胞癌的分化并抑制其进展。突触小泡糖蛋白2A(SV2A)在人类CD8⁺T淋巴细胞中表达，左乙拉西坦可减少CD8⁺T淋巴细胞的穿孔素释放，表明SV2A抑制可能是其功能受损的关键机制。冯·维勒布兰德因子A域包含蛋白5A(VWA5A)作为黑色素瘤肿瘤抑制因子通过下调MITF诱导黑色素瘤细胞从增殖状态向迁移状态转变。半胱氨酸丰富肠蛋白1(CRIP1)通过抑制TFAM介导的线粒体生物发生来抑制皮肤黑色素瘤细胞的增殖和侵袭，同时高CRIP1表达诱导髓源性抑制细胞(MDSC)浸润并促进免疫抑制肿瘤微环境形成。

从临床转化角度看，这10基因预后标签在TCGA和独立验证队列中均显示强大预测性能，为黑色素瘤患者风险分层和个性化治疗提供有力工具。免疫基因集活性差异为预测免疫检查点抑制剂反应提供宝贵见解。具有更强Treg介导的免疫抑制特征的高风险患者可能对PD-1/PD-L1阻断单药治疗产生耐药，需要考虑靶向Tregs的联合疗法或过继性T细胞移植。相反，具有相对活跃免疫应答的低风险患者更可能从免疫检查点阻断中获益。

功能富集分析显示，鉴定的Treg相关基因(TRGs)参与关键免疫调节通路，如抗原加工和呈递、Th17 Treg分化、PIK3-Akt信号传导和自噬。这些通路对免疫耐受和Treg功能至关重要，与先前强调代谢和信号可塑性在维持肿瘤微环境中Treg介导的免疫抑制的研究一致。相关分析显示TRG风险模型与临床特征(包括疾病分期和患者生存)显著相关，表明TRG表达模式可能作为患者分层的有用预后生物标志物。

构建的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络(ceRNA网络)为了解Treg相关预后基因的转录后调控机制提供关键见解。该研究存在几个局限性：分析主要基于TCGA和GEO的转录组数据集，样本量相对有限，缺乏BRAF/NRAS突变状态信息以及治疗细节，可能限制结论的普适性。尽管在细胞模型中验证了预后基因标签的mRNA和蛋白水平，但基因过表达或敲低以阐明其对黑色素瘤生物学影响的功能实验仍有待进行。目前缺乏使用大规模临床组织队列的大规模验证。SKCM亚型的异质性和调节性T细胞的动态可塑性探索不足，强调需要进一步的机制和转化研究。

总之，这项整合分析揭示了SKCM中一种新的Treg相关基因特征，通过关键代谢和信号通路驱动免疫抑制。这些基因作为潜在的预后生物标志物和治疗靶点，以克服黑色素瘤中的免疫抵抗。需要进一步的功能验证和临床研究来阐明其机制并推进转化应用。