基于单细胞测序与机器学习解码结直肠癌化疗与免疫治疗耐药：揭示NOL3的关键作用

《Clinical and Experimental Medicine》：Decoding colorectal cancer chemotherapy and immunotherapy resistance: revealing the role of NOL3 using single-cell RNA sequencing and machine learning

本研究针对结直肠癌(CRC)高度异质性导致的预后预测难题，通过整合缺氧与程序性细胞死亡(PCD)特征，利用13种机器学习算法构建预后模型。研究发现NOL3是关键预后标志物，实验证实其通过调控上皮间质转化(EMT)、HIF信号通路和DNA损伤修复促进CRC恶性进展及治疗耐药。单细胞分析揭示高表达NOL3的上皮细胞通过EGF/SAA/TWEAK信号通路与免疫细胞互作，导致免疫治疗耐药。该研究为CRC个体化治疗提供新靶点。

　　

在全球范围内，结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是癌症相关死亡的第二大原因，约占癌症总死亡率的9.2%。尽管治疗策略取得了显著进展，但5年生存率仍不理想。肿瘤的高度异质性使得准确预测预后变得复杂，而肿瘤微环境中的缺氧条件可通过影响细胞死亡机制，导致对多种抗肿瘤疗法产生耐药性，甚至可能引起复发。程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD)的不同形式在调节癌症进展中至关重要，因此，深入探索CRC中缺氧与PCD机制之间的相互作用具有重要的临床意义。

为了阐明这些尚未清晰的科学问题，研究人员进行了一项大规模分析，整合了四个多中心队列（n=1294）的数据，采用可靠高效的数据处理流程，探索了缺氧与18种PCD特征之间的关联。研究应用了十三种广泛使用的机器学习算法，以识别与缺氧相关的细胞死亡风险特征，并最终选择NOL3作为CRC的关键预后标志物。

研究的核心发现是，NOL3在CRC的恶性进展和治疗耐药中扮演了核心角色。通过细胞功能实验证实，降低NOL3表达能显著抑制CRC细胞的增殖和迁移能力，同时促进细胞凋亡。相反，NOL3过表达则表现出相反的效果。进一步的机制研究表明，NOL3的高表达与多种化疗药物耐药相关。MTT实验评估显示，敲低NOL3增强了Daporinad在CRC细胞中的细胞毒性作用。Western blot分析揭示了NOL3对上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)和缺氧信号通路的影响。此外，高NOL3表达与“免疫沙漠”型肿瘤微环境相关，并且代谢分析表明，NOL3表达升高能促进CRC细胞的糖酵解。

为了在更精细的尺度上理解NOL3的作用，研究人员进一步分析了单细胞RNA测序数据。分析发现，NOL3主要表达于免疫治疗无应答组（non-pCR）的上皮细胞中。CellChat分析提示，高表达NOL3的上皮细胞(High_NOL3_Epithelial)可能通过EGF、SAA和TWEAK等信号通路与多种免疫细胞相互作用，从而参与免疫治疗耐药的发生。

这项研究通过结合缺氧和PCD基因集的特征，建立了一个复合预后模型，并验证了NOL3作为一种双重生物标志物的价值，为CRC患者的预后评估以及免疫治疗和化疗的个体化方案制定提供了重要的临床启示。该论文已发表在《Clinical and Experimental Medicine》期刊上。

为开展此项研究，作者主要运用了几项关键技术方法。研究基于来自TCGA-COAD和GEO数据库（GSE39582、GSE12945、GSE17536）的四个CRC队列（共1294个样本）进行生物信息学分析。通过文献检索获取了1548个PCD相关基因和3020个缺氧相关基因，并利用Pearson相关分析筛选出63个共表达基因用于模型构建。研究核心应用了13种机器学习算法（如XGBoost、RR、RF）来构建和筛选最优预后模型。在实验验证部分，使用了人CRC细胞系（HCT116, HT29）进行基因敲低和过表达，并通过qRT-PCR、Western blot、Edu染色、Transwell迁移实验、细胞凋亡检测、免疫荧光染色、MTT法等技术评估NOL3的生物学功能。此外，还利用CIBERSORT等算法评估免疫细胞浸润，并对单细胞RNA测序数据（GEO accession: GSE205506）进行细胞注释、细胞间通讯（CellChat）和代谢通路（scMetabolism）分析。

风险特征鉴定与预后模型构建

研究人员首先通过整合缺氧和PCD相关基因，识别出416个重叠基因。预后筛查确定了29个PCD相关和63个缺氧相关基因与生存结局显著相关。Pearson相关分析进一步筛选出满足 |R| > 0.6 和 p < 0.001 条件的共表达基因，最终得到一个包含63个基因的预后特征。功能富集分析（GO）显示这些基因显著富集于凋亡信号通路调节等条目。KEGG通路分析则显示它们主要富集在HIF-1和MAPK信号通路。

临床和功能差异

根据中位风险评分将患者分为高危和低危组。在所有研究人群中，高危组患者均表现出显著更差的生存结局。主成分分析（PCA）显示两组之间存在不同的聚类模式。功能注释分析强调，高风险与细胞外基质（ECM）相关过程密切相关，而低风险与增强的抗原呈递机制相关。Cox回归分析证实该风险特征是具有独立预测价值的预后因素，并且与肿瘤分级、疾病分期等关键临床参数显著相关。

通过机器学习方法选择风险特征

利用63个基因构建风险评分，并通过整合13种机器学习算法开发预后预测模型。根据平均AUC值，表现最好的三个模型是XGBoost、RR（Ridge Regression）和RF（Random Forest），平均AUC值达到0.86。值得注意的是，NOL3成为主要因素，在三个模型中的两个里影响力最大，因此被确定为CRC的关键预后指标。

NOL3促进CRC细胞增殖和迁移同时抑制凋亡

通过建立NOL3敲低和过表达的CRC细胞系，研究人员在mRNA和蛋白水平验证了操作效率。功能实验表明，NOL3敲低显著抑制了细胞增殖和迁移能力，并促进了细胞凋亡；而NOL3过表达则产生相反的效果，增强了增殖和迁移，并抑制了凋亡。

NOL3介导的化疗和免疫治疗耐药机制见解

免疫荧光染色结果显示，沉默NOL3增加了γ-H2AX焦点数量，减少了53BP1焦点数量，但不影响RAD51焦点，提示NOL3可能参与同源重组修复，这可能是其导致化疗和免疫治疗无应答的机制之一。Western blot分析进一步表明，沉默NOL3抑制了EMT通路和AMPK/HIF通路。

NOL3的免疫特征

对肿瘤免疫微环境（TIME）的评估显示，NOL3表达与多种免疫细胞浸润模式相关。NOL3表达与静息记忆T细胞、活化记忆T细胞、中性粒细胞等多种免疫细胞呈显著负相关，而与调节性T细胞（Tregs）呈最强的正相关，表明NOL3可能参与塑造免疫抑制微环境。

NOL3在预测药物敏感性方面的功效

药物敏感性分析发现，NOL3表达与多种化疗药物（如Vincristine, Cyclophosphamide）和靶向药物的活性呈负相关，表明NOL3可能诱导CRC耐药。同时，研究筛选出Daporinad作为潜在的NOL3靶向药物，MTT实验证实敲低NOL3能增强Daporinad的细胞毒性作用。

单细胞水平鉴定NOL3

对19例患者的单细胞RNA测序数据进行分析，将细胞分为10个不同的簇并进行注释。发现NOL3主要在无应答组（non-pCR）的上皮细胞中表达。细胞通讯分析显示，高表达NOL3的上皮细胞（high_NOL3_Epithelial）在免疫治疗应答者和无应答者中，与髓系细胞和NK细胞的相互作用强度和数量存在显著差异。

高低NOL3表达状态下上皮细胞通讯的单细胞分析

研究发现，在免疫治疗无应答组中，EGF、SAA、TWEAK等信号通路相对上调。具体而言，在无应答组中，low_NOL3_Epithelial与NK细胞在EGF通路中的相互作用增强；而high_NOL3_Epithelial则通过SAA和TWEAK信号通路与髓系细胞和NK细胞相互作用。高NOL3上皮细胞在EGF和SAA通路中表现出更强的信号发送能力，在TWEAK网络中则显示出更强的信号接收和调节功能。

不同细胞类型的代谢特征

代谢分析显示，高表达NOL3的细胞表现出糖酵解能力增强，但三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化活性降低，这些代谢改变可能与NOL3作为缺氧相关基因的作用密切相关。

研究结论与讨论

本研究成功整合了肿瘤缺氧特征与PCD模式，利用机器学习技术构建了稳健的CRC预后预测模型，并鉴定出NOL3作为关键预后标志物。实验验证表明，NOL3通过促进细胞增殖、迁移，抑制凋亡，激活HIF信号通路、EMT和DNA损伤修复，驱动CRC恶性进展和治疗耐药。单细胞分析进一步揭示了NOL3在塑造免疫抑制微环境和介导免疫治疗耐药中的重要作用，高表达NOL3的上皮细胞通过特定的信号通路（如EGF、SAA、TWEAK）与免疫细胞相互作用。代谢重编程分析表明NOL3与糖酵解增强有关，巩固了其作为缺氧相关基因的功能。

尽管本研究取得了有希望的成果，但仍存在一些局限性，例如主要依赖于生物信息学分析，实验验证仍需深入；样本量和数据来源相对有限。未来需要大规模的前瞻性多中心临床研究来验证NOL3的临床相关性，并进一步阐明其在免疫调节和其他肿瘤相关生物学功能中的具体分子机制。总之，该研究不仅增强了我们对CRC治疗抵抗机制的理解，而且为预后评估和个体化治疗策略的开发提供了新的生物标志物和潜在治疗靶点，具有重要的临床转化价值。