超越油水界面：碱-脂肪酶的协同催化作用在三油精水解过程中诱导出pH响应性的自组装现象

《Journal of Colloid and Interface Science》：Beyond the oil–water interface: Cooperative alkali–lipase catalysis induces pH-responsive self-assembly in triolein hydrolysis

本研究通过SAXS和DLS分析，探究了三种脂酶在pH7.0-11.0范围内催化甘油三酯水解及其自组装行为，发现pH11时形成水包油乳液和双层结构，揭示pH与酶类型对水解及胶束形成的动态影响。

　　

M. Frigerio | M.E. Leser | S. Salentinig

弗里堡大学化学系，Chemin Du Musée 9，1700 弗里堡，瑞士

摘要

甘油三酯在脂肪酶催化和碱性条件下的水解会产生两亲性分子，这些分子能够重新组织油水界面，并在油和水中形成具有特定胶体特性的超分子组装体。本文对一种由三油精和缓冲液组成的双相体系在pH 7.0–11.0范围内进行碱性处理或通过Sus scrofa、Rhizomucor miehei和Thermomyces lanuginosus脂肪酶催化的水解过程进行了结构和成分分析。小角X射线散射（SAXS）和动态光散射（DLS）结果显示，在pH值低于9.0时结构变化很小。而在pH值为11.0时，反应驱动的自组装会在油相中产生水包油乳液和类双层结构，这些结构主要由油酸稳定。在水相中则形成了油膨胀的胶束和囊泡，其大小和形态取决于水解条件。这些纳米结构与产物成分和界面富集的变化相关，显著增加了可用的界面面积。虽然之前的研究已经探讨了脂肪酶催化的脂质水解过程，但据我们所知，尚未有研究同时揭示在酶促和碱性条件下油相和水相的结构演变。本研究揭示了水解、两亲性分子的生成以及pH依赖性自组装之间的直接联系，这对理解脂质消化、界面催化以及pH响应性胶体材料的设计具有重要意义。

引言

酶催化和碱催化是甘油三酯水解的两大主要途径[1]。工业上生产脂肪酸通常采用非催化水解方法，例如Colgate-Emery系统中使用的油和水的高压逆流工艺[2]。相比之下，甘油三酯与甲醇的碱催化酯交换反应是生物柴油生产的基础[3]，这是减少对化石燃料依赖的关键策略之一[4,5]。在各种工业应用中，Thermomyces lanuginosus产生的脂肪酶（TL）表现出广泛的适用性，从生物柴油生产到精细化学品合成都有应用[6]。在人体内，酶催化的水解也是主要途径[7]。这些酶可以表现出非特异性活性或区域选择性，即能够区分甘油骨架上的初级（sn-1,3）和次级（sn-2）酯键[8]。 脂肪酶与食品乳液中的胶体脂质结构之间的相互作用[9,10]引起了越来越多的关注，因为这关系到功能性食品材料的设计，这类材料可以调节消化过程[11,12]。在胃肠道中，pH环境变化显著：胃部的pH值为1.0–2.5[13]，十二指肠约为6.0[14]，末端回肠约为7.8[15]。脂肪酶通常在pH 7到9的范围内表现出最大活性[16]。然而，特别是在类似于工业碱催化过程中使用的强碱性条件下，pH对酶催化水解的影响仍不甚清楚[13]。 由于甘油三酯的消化始于油水界面，因此界面性质至关重要。先前的研究已经探讨了pH对甘油三酯-水界面的影响，发现油酸的pH依赖性离子化会驱动三油精-油酸乳液中的界面和胶体转变[11]。将pH从7.0升高到9.0时，三油精/缓冲液的界面张力从32.4 mN/m降低到2.2 mN/m，并观察到了纳米结构界面的形成[17]。本研究表明，酶和pH引发的水解过程会重新组织大尺度纳米结构，这些结构会与界面动态交换物质并重塑界面。 尽管TL酶的最佳活性pH约为9[18]，但在pH 8.5时三油精的消化速率低于pH 7.0[19]。这可能是由于形成了油酸钙复合物，这些复合物会阻碍水解过程[19]。在较高的pH值下，这种复合物变得更为重要，因为油酸的pKa值（7.0 < pKa < 9.5）在自组装结构中起作用[20]。 水分含量也是影响脂肪酶活性的另一个因素[21]。例如，当水分含量相对于油的比例超过3.6%（v/v）时，TL酶在棕榈油中的活性会降低[22]。甘油三酯（如三油精）可以溶解水，观察到三油精薄膜与TRIS缓冲液接触后会膨胀[19]。这种行为是由于甘油三酯在其液态下难以形成明确的片状结构[23]。在与水接触的单层中，甘油三酯采取E型构象，其亲水基团朝向水界面，烷基链朝同一方向排列[24]。然而，这种构象造成的空间阻碍使得后续层中的两个脂肪酸链朝一个方向排列，而第三个脂肪酸链朝相反方向排列[25]。甘油三酯中的这些结构特征显著影响了其与表面活性物质（如脂肪酶[26]、单甘油酯[27]和脂肪酸[11]的相互作用。例如，甘油三酯在微乳液中的溶解性较差，这归因于其轻微的两亲性[28]。其较弱的两亲性使得甘油三酯表现出类似共表面活性剂的行为，从而干扰了它们与表面活性剂的混合或溶解到胶束和乳液中的能力[29]。 尽管之前的研究主要关注生理pH范围内的油酸-三油精乳液和脂质消化过程，但对不同脂肪酶在广泛pH范围内的作用机制仍缺乏系统性的理解，包括强碱性条件。本文结合了SAXS、DLS、Karl-Fischer滴定和酸碱滴定方法，阐明了酶活性与油水界面处pH依赖性纳米结构形成之间的耦合关系。通过对Thermomyces lanuginosus、Sus scrofa和Rhizomucor miehei脂肪酶的比较分析，揭示了碱性环境如何调节催化效率和自组装过程，将界面反应动力学与脂质消化和工业水解的相关过程联系起来。

材料与方法

使用Metrohm 913 pH计（Metrohm，Herisau，瑞士）测量pH值。缓冲溶液（0.1 M磷酸氢钠，PB；Sigma-Aldrich，Darmstadt，德国，纯度≥98.0%）在超纯水中（电阻率ρ > 18 MΩ·cm）配制，并用NaOH和HCl溶液调整至所需pH值。NaOH和HCl溶液分别由NaOH颗粒（Merck，Darmstadt，德国，纯度≥99.0%）和浓HCl（37%，Fisher Scientific，Waltham，MA，分析试剂）制备。

结果与讨论

甘油三酯的水解会断裂酯键，生成二甘油酯、单甘油酯和游离脂肪酸[17]。对于三油精而言，油酸（OA）是碱催化和酶催化水解的主要产物，其浓度常被用作反应进展的指示物[50]。由于两亲性产物会自组装并稳定乳液，我们结合了化学分析和结构分析来表征这些系统。

结论

结果表明，三油精的水解及其水解产物的自组装在油相和水相中都强烈依赖于pH值和脂肪酶类型。在pH 7.0和9.0时，无论是否有脂肪酶存在，SAXS数据显示两相的结构变化都很小。而在pH 11.0时，出现了复杂的相行为。在脂肪酶存在的情况下，SAXS和DLS显示油相中形成了反相乳液滴。

CRediT作者贡献声明

M. Frigerio：撰写初稿、可视化处理、验证、方法论设计、实验研究、数据分析。 M.E. Leser：审稿与编辑、监督工作、方法论设计、概念构思。 S. Salentinig：审稿与编辑、撰写初稿、验证、资源管理、项目协调、方法论设计、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。

致谢

本工作得到了瑞士国家科学基金会（项目编号：192051）和国家生物启发材料研究能力中心的支持。