CYP3A4中静电分布对三唑仑代谢区域选择性的影响以及铁自旋状态对其代谢速率的调节：基于分子动力学模拟和量子化学计算的见解

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Impact of electrostatic distribution in CYP3A4 on the regioselectivity of triazolam metabolism and regulation of its metabolic rate by the iron spin states: Insights from MD simulations and QM calculations

三唑仑代谢机制研究：通过分子对接、经典及加速分子动力学模拟及量子力学计算，揭示CYP3A4催化三唑仑形成α-OH-TRZ和4-OH-TRZ的代谢选择性机制，发现铁离子自旋态（四重态）调控代谢速率（5.96 s-1），主导构象A中Cα-H氢键网络关键作用，并建议引入芳环提高代谢稳定性。

　　

赵燕|马欣宇|郑青川

吉林大学药学院，长春130023，中国

摘要

三唑仑（TRZ）是一种代表性的苯二氮卓类镇静催眠药物，由于社会压力的不断增加，其滥用现象逐渐加剧。为了进一步为TRZ的合理使用提供理论基础，并获取更多关于其代谢过程的信息，本研究采用人CYP3A4作为代谢酶，通过多种计算方法探讨了TRZ的代谢机制。研究发现，与TRZ代谢物多样性相关的三种底物结合构象（构象A、构象B和构象C）被识别出来。“三明治”结构以及TRZ与F304/卟啉环之间的π-π堆叠可能是决定这三种底物结合构象的关键因素。此外，构象A是主要的结合模式，其中Cα-H位点是关键的代谢位点，CYP3A4催化的Cα-H羟基化过程遵循氢提取-反弹机制。更重要的是，在羟基化过程中，铁的自旋状态可以调节TRZ的代谢速率，其中四重态自旋状态下的代谢速率最高（5.96?s^?1）。根据我们的研究结果，可以在TRZ中合理引入芳香基团以提高其代谢稳定性。同时，血红素铁从低自旋状态转变为高自旋状态似乎会加速TRZ的代谢，这可能导致α-OH三唑仑在体内的积累，从而对人类健康构成风险。这些结果有助于我们更好地理解CYP3A4介导的TRZ的区域选择性代谢，并为其他三唑类药物的代谢研究提供理论基础和新视角。

引言

苯二氮卓类药物是全球使用最广泛的精神药物之一[[1], [2], [3], [4]]，常用于治疗焦虑、失眠和恐慌症[[5], [6], [7]]。随着第二代短效苯二氮卓类药物的发展，三唑仑（TRZ）因其独特的化学结构、快速起效和短效作用时间而脱颖而出[[8,9]]。

三唑仑（TRZ）具有[1,4]苯二氮卓的核心结构（图1，A），其中三唑环取代了1和2位点，形成了三唑苯二氮卓骨架（图1，B）。R1位点被氯原子取代，增强了其脂溶性并在中枢神经系统中提高了活性[[10], [11], [12]]。与其他“唑仑”类药物（如咪达唑仑）相比，结构修饰改变了TRZ的药理特性，使其半衰期缩短，受体亲和力显著增强，对老年人的敏感性也更高[[13,14]]。短期和适量使用TRZ可能是治疗成人和老年人失眠的最佳选择[[15], [16], [17], [18]]。然而，风险与收益总是并存的。TRZ的使用常伴随多种不良反应，如痴呆、成瘾甚至死亡[[16,19]]。随着社会压力的增加，TRZ的滥用现象日益严重，这些药物的副作用也开始显现，对人们造成了严重危害[[20,21]]。研究TRZ的代谢过程对于减少其不良反应至关重要。目前，大量研究表明TRZ在人体内主要通过CYP3A4代谢为两种羟基化产物：α-羟基三唑仑（α-OH-TRZ）和4-羟基三唑（4-OH-TRZ）（图2）。经¹⁴C标记的TRZ给药后，α-OH-TRZ和4-OH-TRZ分别占尿液中¹⁴C活性的69?%和11?%[[22], [23], [24], [25], [26]]。α-OH-TRZ是唯一具有药理活性的TRZ代谢物，其活性约为母体的50?%[[27,28]]。药代动力学实验表明，CYP3A4对TRZ的快速代谢会导致TRZ和α-OH-TRZ的血浆浓度显著波动，从而增加毒性风险[[23,24]]。目前，通过实验方法识别TRZ代谢酶和代谢物的技术已经成熟，但TRZ代谢的区域选择性和具体机制仍大部分未知。

理论计算方法比实验方法更方便、高效且成本更低，能够获取纳秒（ns）时间尺度上的原子级和分子级动态信息，已被广泛应用于研究酶催化的底物代谢机制[[29], [30], [31], [32], [33]]。在本研究中，我们利用分子对接、经典分子动力学（cMD）、加速分子动力学（aMD）、量子力学（QM）和动力学计算来探索CYP3A4介导的TRZ代谢过程，明确TRZ在CYP3A4中的结合模式和关键因素，并揭示了多重性对羟基化过程的影响。这些结果将有助于从分子层面理解TRZ的代谢机制，深入探讨CYP3A4介导的TRZ的区域选择性代谢，并为其他唑类和三唑类药物的代谢研究提供理论基础和新视角。

部分内容摘录

模型制备

CYP3A4是参与药物代谢的关键酶。目前，蛋白质数据库（http://www.rcsb.org）中的117个人类CYP3A4晶体结构都存在N端螺旋缺失的问题[[34,35]]，分辨率范围从1.70??到3.40??不等。N端螺旋的缺失限制了我们对CYP3A4功能及其机制的深入理解[[36,37]]。为克服这一限制，我们采用了多模板同源建模方法，利用CYP3A4的晶体结构进行建模。

完整的CYP3A4结构

CYP3A4晶体结构的不完整性影响了对其功能的理解[[36,37]]。在本研究中，成功构建了完整的CYP3A4结构，以更好地理解其结构和功能特性（图S1）。使用PROCHECK [44]计算的Ramachandran图（图S1）显示，92.5?%的残基位于有利区域，98.2?%的残基位于允许区域。为了进一步评估模型的稳定性，我们进行了60?ns的cMD模拟。

结论

总之，本研究通过多种计算方法（分子对接、经典分子动力学（cMD）模拟、加速分子动力学模拟（aMD）、量子力学（QM）计算和动力学计算），详细描述了TRZ在人类CYP3A4中的结合模式、代谢区域选择性和代谢途径。研究发现，TRZ在CYP3A4中有三种底物结合构象，其中MDZ的Cα基团与...

CRediT作者贡献声明

赵燕：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始稿、可视化、验证、方法学、研究、形式分析、数据整理。马欣宇：方法学、研究、形式分析。郑青川：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金争取。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：22073036）和吉林大学诺曼·白求恩健康科学中心“医学+X”跨学科创新团队（编号：2025JBGS08）的财政支持。