《Journal of Insect Physiology》：Euschistus heros RNase silencing: dsRNA stability and effects on RNAi susceptibility
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RNAi效率受唾液腺RNase活性主导，中肠次之，血淋巴活性低。通过RNAi抑制RNase基因表达，虽提升dsRNA稳定性，但未显著增强对V-ATPase基因沉默的效果，揭示存在其他生理屏障。
Daniel Estiven Quiroga-Murcia | éricmar Avila dos Santos | Kristof De Schutter | Moises J. Zotti
巴西佩洛塔斯联邦大学，农学系Eliseu Maciel，Cap?o do Le?o 96010-610
摘要
核酸酶（RNase）活性是限制RNAi诱导基因沉默效果的主要因素之一，尤其在许多昆虫物种中尤为明显。在Euschistus heros中，双链RNA（dsRNA）的降解主要发生在与唾液接触时，而中肠液具有中等的降解活性，血淋巴中的RNase活性则极低或不存在。已在唾液腺中确认了RNase基因的高表达水平，在中肠中也有少量表达。为了评估这一屏障对RNAi效果的影响，设计了一种基于“RNAi-of-RNAi”的策略：首先通过显微注射针对RNase基因的dsRNA（dsRNase），随后再通过口服方式给予针对V-ATPase基因的dsRNA（dsVATP-ase）。这种方法成功降低了RNase基因的表达，并显著减少了唾液和中肠提取物中的dsRNA降解。然而，RNase的抑制并未显著提高Euschistus heros对dsVATP-ase的敏感性，这表明该物种还存在其他限制RNAi效果的屏障。这些结果强调了减轻酶降解的重要性，同时也突出了需要采用互补方法来克服其他生理屏障，以提高RNAi作为Euschistus heros控制工具的有效性。
引言
RNA干扰（RNAi）是一种存在于大多数真核生物中的细胞基因调控和防御机制。尽管不同真核生物之间存在进化差异，但RNAi仍是一种古老且高度保守的机制（Fire等人，1991年；Horak等人，xxxx年；Yan Zhu等人，2020年；Zotti等人，2018年）。尽管其发现相对较晚（不到50年前），RNAi已经在分子生物学领域取得了重大进展。该机制在转录后水平发挥作用：RNA诱导的沉默复合体（RISC）会靶向并降解从核DNA转录的信使RNA（mRNA）。这种降解发生在mRNA与siRNA分子配对时，而siRNA是由细胞质中的双链RNA（dsRNA）处理产生的（De Carvalho等人，1992年），从而阻止mRNA翻译成蛋白质。虽然RNAi在生物体内的全部功能尚未完全阐明，但已知它在抗病毒防御、抑制转座子和调控基因表达中发挥作用。
在基于RNAi的害虫控制中，昆虫通过口服方式接触dsRNA，而核酸酶活性是限制基因沉默效率的关键屏障（Cao等人，2018年；Christiaens等人，2014年）。核酸酶存在于胃系统和血淋巴中，但它们的活性在不同昆虫中存在差异。例如，在蜚蠊目（Blattodea）、直翅目（Orthoptera）、双翅目（Diptera）和鞘翅目（Coleoptera）中，核酸酶活性主要集中在中肠（Dalaisón-Fuentes等人，2023年；Fan等人，2021年；Garcia等人，2017年；Huang等人，2018年；Peng等人，2020年；Pugsley等人，2024年；Spit等人，2017年；Tayler等人，2019年；Wynant等人，2014年；Yoon等人，2023年；Song等人，2017年）。相比之下，鳞翅目（Lepidoptera）的血淋巴中dsRNA降解活性最高（Fan等人，2021年；Abreu Reis等人，2022年；Cooper等人，2020年；Zhang等人，2022年；Garbutt等人，2013年；Guan等人，2018年；Li等人，2022年；Zhou等人，2024年），尽管某些物种如Spodoptera frugiperda和S. exigua的中肠中也表现出较高的核酸酶活性（Zhou等人，2024年；Christiaens等人，2018年）。
在某些膜翅目（Hymenoptera）物种中，唾液是核酸酶活性的主要场所（Allen和Walker，2012年；Lomate和Bonning，2016年；Peiffer和Felton，2014年；Sharma等人，2021年）。而在蚜虫（如Acyrthosiphon pisum）中，血淋巴、中肠和唾液中都检测到高水平的核酸酶（Cao等人，2018年；Christiaens等人，2014年）。不同物种和组织中的核酸酶数量、表达量和活性也存在差异。例如，在Spodoptera litura、Ostrinia furnacalis和Tribolium castaneum中至少发现了四种能够降解dsRNA的内切核酸酶（Fan等人，2021年；Peng等人，2020年；Peng等人，2020年）。相比之下，在Euschistus heros、N. viridula和H. halys中仅发现一种核酸酶，尽管该核酸酶具有多种亚型（Sharma等人，2021年；Cagliari等人，2020年）。
这种不同昆虫目中核酸酶定位和活性的差异给RNAi在害虫控制中的有效应用带来了相当大的挑战。已经开发了几种策略来保护dsRNA免受酶降解，包括使用聚合物或其他载体来提高RNAi的效果（Christiaens等人，2018年；Prentice等人，2019年；Castellanos等人，2019年；Dhandapani等人，2019年；Kolge等人，2023年；Kolge等人，2021年）。此外，还研究了dsRNA的结构修饰，以降低其对核酸酶的敏感性同时保持沉默活性（Lyu等人，2023年；Howard等人，2022年）。基于“RNAi-of-RNAi”的研究强调了核酸酶在调节基因沉默中的重要性（Dalaisón-Fuentes等人，2023年；Zhang等人，2022年；Sharma等人，2021年；Hunter和Wintermantel，2021年）。这种策略首先沉默一个本身不会立即导致死亡或产生显著致死效应的基因，但该基因在调节对RNAi的反应中起着关键作用。抑制这一基因可以提高随后对关键基因的沉默效率。
本研究的主要目的是评估RNase对Euschistus heros中RNAi效果的影响。这包括分析RNase基因在不同组织中的差异表达，评估RNase基因沉默对dsRNA与昆虫唾液接触稳定性的影响，以及通过评估死亡率和基因表达来研究RNase抑制如何影响昆虫对口服dsRNA的敏感性。
部分摘录
昆虫育种
E. heros来自根特大学控制条件下维护的实验室群体。这些昆虫被放置在塑料容器中，并保存在设置为24°C、60%相对湿度和16:8小时光照周期（光照：黑暗）的培养箱中。它们的食物包括新鲜豆荚（Phaseolus vulgaris）、花生种子（Arachis hypogaea）和向日葵种子（Helianthus annuus）。发育阶段——卵、若虫和成虫——分别进行饲养。
Euschistus heros中RNase的系统发育特征和差异表达
E. heros的RNase与其他臭虫的RNase同属于半翅目（Hemiptera）的RNA酶簇，反映了按目划分的系统发育关系。在五节虫科（Pentatomidae）中，N. viridula的蛋白质最短，而P. stali在序列同一性百分比上与E. heros最为接近（见补充信息图S1）。所有这些RNase都具有高水溶性（负GRAVY指数），并且预计是细胞外的。不同臭虫之间的等电点相当相似，这与...
讨论
昆虫消化系统中的RNase活性被认为是导致RNAi抗性的关键因素之一。在口服暴露过程中，唾液和中肠中的核酸酶会在分子被细胞吸收之前将其降解（Yan Zhu等人，2020年；Christiaens等人，2014年；Hunter和Wintermantel，2021年；Palli，2023年）。此外，在某些生物中，RNase也存在于血淋巴中（Cao等人，2018年；Christiaens等人，2014年；Zhang等人）
CRediT作者贡献声明
Daniel Estiven Quiroga-Murcia：撰写——初稿、方法论、研究、数据分析、概念化。
éricmar Avila dos Santos：撰写——审稿与编辑、方法论。
Kristof De Schutter：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、方法论、研究、资金获取、概念化。
Moises J. Zotti：撰写——审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢Danielle Barros教授在实验程序方面的协助。我们衷心感谢巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）、南里奥格兰德州创新战略技术网络（RITES-FAPERGS/RS）和哥伦比亚未来基金会（COLFUTURO）提供的奖学金，以及根特大学（比利时）和佩洛塔斯联邦大学（巴西）的支持。
