免疫蛋白酶体抑制在B细胞谱系中触发蛋白应激与凋亡但不影响疫苗接种诱导的抗体反应

《Cell Death Discovery》：Immunoproteasome inhibition triggers protein stress and apoptosis in cells of B cell lineage without impairing vaccination-induced antibody responses

本研究针对免疫蛋白酶体(IP)抑制是否影响抗病毒体液免疫这一关键问题，探讨了选择性IP抑制剂ONX 0914对B细胞功能及抗体产生的影响。研究人员发现，体外持续抑制IP会引发B细胞内未折叠蛋白反应(UPR)，导致多聚泛素化蛋白积累、细胞凋亡增加和抗体分泌减少；然而在体内病毒感染和疫苗接种模型中，IP抑制并未损害病毒中和抗体滴度和疫苗效力。该成果为IP靶向疗法治疗自身免疫病而不削弱保护性免疫提供了重要依据。

　　

在免疫系统的精密调控网络中，免疫蛋白酶体(Immunoproteasome, IP)作为26S蛋白酶体的特殊形式，通过其催化亚基LMP2、MECL-1和LMP7替代标准蛋白酶体的β1c、β2c和β5c亚基，在抗原呈递和免疫调节中扮演着关键角色。特别是在造血细胞中，IP的组成型表达及其在炎症条件下的诱导上调，使其成为自身免疫疾病治疗的重要靶点。然而，一个令人担忧的问题始终悬而未决：选择性抑制IP在治疗自身免疫病的同时，是否会像广谱蛋白酶体抑制剂那样，影响机体正常的抗体应答，特别是疫苗接种后保护性抗体的产生？

以往研究表明，浆细胞作为抗体分泌的核心细胞，其存活和功能高度依赖于高效的蛋白酶体系统来维持蛋白质稳态。临床使用的非选择性蛋白酶体抑制剂如硼替佐米(bortezomib)或卡非佐米(carfilzomib)虽能有效治疗多发性骨髓瘤，但因其严重副作用限制了广泛应用。这就引出了本研究要解决的核心科学问题：选择性IP抑制能否在有效控制自身免疫反应的同时，保持疫苗接种诱导的保护性免疫？

为了回答这一问题，研究人员在《Cell Death Discovery》上发表了他们的最新发现。他们利用LMP7/LMP2选择性抑制剂ONX 0914，通过一系列精巧的实验设计，系统评估了IP抑制对B细胞功能和抗体应答的影响。

研究团队采用的关键技术方法包括：利用他莫昔芬(4-OHT)诱导的LMP2/LMP7人淋巴母细胞系LCL721-G27模型进行体外机制研究；从野生型C57BL/6和LMP7^-/-基因敲除小鼠获取原代脾细胞进行功能分析；使用人外周血单核细胞(PBMCs)验证物种间一致性；通过痘苗病毒WR(WR-WR)感染模型和两种不同的卵清蛋白(OVA)疫苗接种模型（PLGA微球/聚肌胞苷酸(Poly I:C)和完全弗氏佐剂(CFA)/OVA）进行体内效果评估；结合蛋白质印迹、流式细胞术、ELISA、ELISpot和空斑减少中和试验等多种技术手段全面评估细胞反应和抗体功能。

免疫蛋白酶体抑制在B细胞淋巴瘤细胞系中诱导UPR、增加细胞死亡并减少抗体分泌

研究人员首先在IP可诱导的人淋巴母细胞系LCL721-G27中证实，ONX 0914处理显著上调了内质网应激关键基因CHOP的表达，并促进了XBP1的剪接(sXBP1)，同时导致多聚泛素化蛋白大量积累。这些发现表明IP抑制确实激活了未折叠蛋白反应(UPR)通路。更重要的是，在表达IP的细胞中，持续ONX 0914处理(≥300 nM)导致细胞凋亡增加和IgG抗体分泌减少，而在仅表达标准蛋白酶体的未诱导细胞中未见此效应。

免疫蛋白酶体抑制活化的原代小鼠脾细胞和人PBMCs导致B细胞谱系减少和IgM、IgG抗体分泌降低

在LPS激活的原代小鼠脾细胞中，ONX 0914处理以剂量依赖方式减少了野生型小鼠中CD19⁺细胞、CD19⁺IgM⁺细胞和CD19⁺CD138⁺浆母细胞的数量，而LMP7^-/-小鼠细胞仅在较高浓度下才受影响。 Annexin V/PI染色证实ONX 0914诱导了野生型CD19⁺细胞的凋亡。 ELISA分析显示ONX 0914剂量依赖性地降低了野生型细胞上清中IgM和IgG的分泌量。在人PBMCs中也观察到类似趋势，CD19⁺B细胞数量显著减少。

免疫蛋白酶体抑制抑制原代小鼠CD19⁺细胞的体外类别转换

通过CD40L刺激诱导B细胞类别转换，研究人员发现ONX 0914处理(≥100 nM)显著增加了CD19⁺IgM⁺细胞比例，同时降低了IgG和IgG2b阳性细胞比例。在IL-4存在下诱导的IgG1和IgE类别转换也受到类似抑制。上清中IgM分泌的增加进一步支持了ONX 0914抑制了从IgM向其他同种型转换的过程。

体内IP抑制不影响抗体中和能力

在痘苗病毒感染模型中，尽管体外实验显示IP抑制对B细胞有显著影响，但ONX 0914处理(10 mg/kg，每周三次)的小鼠血清在感染后28天仍表现出与载体对照组相当的病毒中和能力，表明IP抑制在体内不影响功能性抗体应答的建立。

预防性ONX 0914治疗在OVA疫苗接种模型中不影响血清抗OVA抗体滴度

在两个不同的OVA疫苗接种模型中，从免疫前一天开始给予ONX 0914预防性治疗，持续至第28天。 ELISpot分析显示，ONX 0914处理组脾脏中IgM分泌细胞略有增加（CFA/OVA模型中有统计学意义），但脾脏和骨髓中IgG分泌细胞数量无显著变化。血清ELISA分析在第21天和第28天均未发现IgM或IgG抗体滴度的组间差异。流式细胞术分析也表明，长期ONX 0914治疗不影响脾脏和骨髓中B细胞(CD19⁺IgM⁺B220⁺)和浆细胞(CD19^-CD138⁺BLIMP-1⁺)的数量和比例。

在OVA疫苗接种模型后期给予ONX 0914不影响血清抗OVA抗体滴度

为了模拟“治疗性”干预，研究人员在免疫后21天（当B细胞应答已建立）开始ONX 0914治疗，持续至第35天。结果显示，ONX 0914处理对脾脏和骨髓中IgM或IgG分泌细胞数量无显著影响，血清抗体滴度在各时间点也无组间差异。流式细胞术分析证实，B细胞和浆细胞群体基本不受影响。

研究结论与讨论部分强调，尽管体外实验明确显示IP抑制通过激活UPR通路诱导B细胞和浆细胞凋亡，并抑制免疫球蛋白类别转换，但这些效应在体内疫苗接种和病毒感染模型中并未转化为对保护性抗体应答的实质性损害。这种差异可能源于体内微环境中存在的补偿机制，如APRIL、IL-6和BAFF等浆细胞生存因子的保护作用，以及ONX 0914在体内的药代动力学特性（半衰期较短）导致的间歇性而非持续性IP抑制。

值得注意的是，本研究发现的体内外差异与某些自身免疫病模型中获得的结果形成对比，后者显示IP抑制能降低自身抗体水平。这种背景依赖性效应提示，高分泌活性的自身反应性浆细胞可能对IP抑制更为敏感，而正常免疫应答中的浆细胞则相对耐受。

该研究的临床意义在于为IP靶向疗法（如临床候选药物Zetomipzomib/KZR-616）的安全性提供了重要证据，表明选择性IP抑制可能在自身免疫病治疗中提供一个有利的治疗窗口，既能有效控制病理性免疫反应，又不明显损害保护性疫苗接种效果。然而，研究者也指出需进一步探讨IP抑制对高度分泌性浆细胞（如自身反应性浆细胞）的选择性效应机制，以及不同给药方案（如脉冲式 versus 持续性抑制）对免疫细胞功能的差异化影响。