细菌流行期间大型结构多态性的快速进化：Daphnia magna基因组中超级基因与免疫防御的新发现

《Heredity》：Rapid evolution of a large structural polymorphism during a bacterial epidemic

本研究针对传统群体遗传学难以解析大型结构变异的问题，以Daphnia magna-Pasteuria ramosa宿主-寄生虫系统为模型，通过长读长测序技术发现染色体5上存在一个2-5 Mb的大型结构多态性区域（LSP）。该区域包含非重叠基因集，其中单倍型LSP-5-1.1与细菌易感性近乎完全相关，并在自然流行病中呈现快速负选择。研究首次揭示该区域通过平衡选择维持多态性，为宿主-寄生虫协同进化提供了基因组学新视角。

　　

在微观的水生世界里，一种名为Daphnia magna的水蚤与致病细菌Pasteuria ramosa之间，正在上演一场持续数百万年的军备竞赛。这种细菌能导致水蚤不育并死亡，而水蚤则通过遗传变异来发展抵抗力。传统遗传学研究主要关注单核苷酸多态性（SNP）等小型变异，但对大型基因组结构变异如何影响宿主-寄生虫相互作用知之甚少。

问题的关键在于，传统短读长测序技术和单一参考基因组的方法，难以准确捕捉大型结构变异。这些变异可能包含重要的功能基因，特别是在免疫相关区域。当基因组区域存在高度分化时，测序读数甚至无法正确比对到参考基因组上，导致这些可能具有重要生物学意义的区域被忽视或错误解读。

为了解决这一难题，研究人员将目光投向了长期研究的Daphnia magna-Pasteuria ramosa系统。在瑞士Aegelsee湖的自然种群中，季节性细菌流行病的爆发为研究宿主抵抗力的进化提供了理想模型。此前研究已发现，对P. ramosa菌株P20的抵抗力由位于染色体5上的E位点控制，但该位点的精确定位一直难以捉摸。

研究人员采用了多学科交叉的研究策略，主要包括：对21个Daphnia magna长读长基因组进行基因预测和功能注释；通过OrthoFinder进行直系同源基因聚类分析；使用Genespace软件进行基因组共线性可视化；对258个野生样本进行全基因组短读长重测序和基于测序深度的基因分型；利用GATK进行变异检测并计算连锁不平衡（LD）；通过荧光标记孢子附着实验评估对Pasteuria ramosa五种分离株的抵抗力表型。

Observation of extreme linkage chromosome 5

研究人员通过扫描来自Aegelsee湖种群的基因组数据，在染色体5上发现了一个先前未被检测到的大型连锁区块。该区块几乎覆盖了整个右染色体臂，仅在端粒附近有一小段除外，同时还包含着丝粒附近左臂的一部分。这一连锁不平衡区块两侧均有约1Mb的高度重复序列区域。该区块内的等位基因变异在长达13Mb的距离上表现出高度连锁性（R2>0.9）。与此形成对比的是，染色体其他位置（以及其他染色体上）的变异通常在小于100Kb的距离上就表现出独立分离。考虑到该种群每年至少进行一次有性生殖，且估计约有60年历史，这种连锁模式表明存在一种局部抑制染色体大部分区域重组的机制。

Multiple haplotypes in Lake Aegelsee

研究发现，在染色体5连锁不平衡区块内存在一个大区域，不同样本在该区域的短读长比对率差异很大。该区域大小从2到5Mb不等，取决于单倍型，边界由所有检查基因组共享的保守侧翼序列定义。研究人员通过迭代地将258个Daphnia magna样本的全基因组Illumina短读长比对到三个不同的基因组组装上，每个组装在该LSP区域纯合不同的单倍型。基于相对比对深度的基因分型方法能够对256个样本中的高度分化区域进行明确基因分型。结果显示，只有三种单倍型在Aegelsee湖该LSP区域以显著频率分离，所有样本被清晰分类为三种单倍型的各种组合的杂合或纯合。这三种单倍型被命名为LSP-5-1.1（单倍型1）、LSP-5-1.2（单倍型2）和LSP-5-1.3（单倍型3），分别包含2.5-95.6Mb的唯一序列内容，其中单倍型1的大小约为其他两种的两倍。

Linking the LSP region to bacterial parasite resistance

研究结果显示，单倍型1与对P20感染的易感性密切相关，并遵循与先前描述的E位点遗传模型一致的显性模式。携带至少一份单倍型1拷贝的20个克隆系中有16个（80%）完全易感于P. ramosa分离株P20的感染。相反，包含单倍型2和3组合（即基因型2/2、3/3和2/3）的69个克隆系中有68个（99%）完全抵抗分离株P20的感染。这些结果强烈表明，先前描述的Pasteuria抵抗力E位点包含在染色体5的LSP区域内，单倍型1对应于对P20易感性的显性E等位基因，而单倍型2和单倍型3都对应于隐性e等位基因（P20抵抗）。

Rapidly shifting LSP haplotype frequencies in Lake Aegelsee

对Aegelsee湖的长期野外观察数据提供了平衡选择响应季节性Pasteuria ramosa爆发的直接表型证据。每年，随着流行病在初夏出现，P20 Pasteuria抵抗基因型的频率急剧增加。这种表型变化在基因组水平上得到反映，表现为染色体5LSP区域内单倍型频率的剧烈变化。在每个野外季节开始时（P. ramosa流行病前1-2个月），所有三种单倍型以大致相等的频率被观察到。然而，在强选择期间，与P20易感性密切相关的单倍型1的频率迅速下降。在流行病夏季高峰后采样的382个单倍型中，单倍型1仅发现6次（1.6%），而单倍型2和单倍型3分别增加到50.8%和47.6%。这种对单倍型1的强烈季节性选择被其每年春季的反复重现所平衡，表明存在一种维持种群中单倍型多样性的平衡选择机制。

Candidate genes for the E locus

通过基因预测和功能注释工具的组合，研究人员在三种单倍型中共鉴定出431个基因，其中只有13个（3%）是所有三种单倍型共享的。基因预测模型显示，单倍型1包含182个私有基因，而单倍型2和单倍型3分别包含90个和89个私有基因。从这份相对较大的候选基因列表中，仅在单倍型1上发现的两个岩藻糖基转移酶基因特别值得关注。岩藻糖基转移酶参与蛋白质的糖基化，通常与细菌附着宿主组织有关，并特别与P. ramosa附着D. magna有关。作为对比，研究人员在左臂染色体5上使用同等大小的4Mb控制区域重复了这一分析，该区域位于连锁不平衡区块之外，并在每个参考基因组的单个contig中包含。在该区域共鉴定出551个基因，其中493个（89%）在所有三个基因组组装中被发现。这些结果证实，染色体5的LSP区域是D. magna基因组中一个高度独特的结构特征。

Many divergent haplotypes are found within the chromosome 5 LD block

为了探索这一高度分化单倍型区域的更广泛背景，研究人员对来自北半球种群的21个Daphnia基因组组装进行了染色体5的比较结构分析。总共从21个基因组组装中恢复了10个高度分化的单倍型，每个单倍型在LSP区域都显示出与所有其他单倍型的大程度分化。结果显示，在大部分右染色体臂上存在显著的结构分化程度，大多数单倍型之间几乎没有可辨别的同源性。相比之下，同一染色体的左臂在所有基因组组装中显示出强同源性，包括一个D. similis外群。通过OrthoFinder量化这种分化，发现左臂定位的基因中有76%（880个中的1164个）在基因组组装面板中保守，而右臂定位的基因中只有29%（174个中的602个）保守。

这项研究揭示了平衡选择作用于大型结构多态性的显著案例，展示了由寄生虫驱动的基因型频率的明显周期性变化。尽管存在强烈且反复的对P20易感性的选择，易感单倍型每年春季当水蚤从越冬的休眠卵中孵化时，仍以中等频率重新出现。这种选择与持久性的反复循环强调了宿主-寄生虫协同进化的动态性质，并突出了平衡选择在维持自然种群中极端单倍型分化的作用。

该LSP区域可能代表一个古老的非重组结构多态性。在其进化早期阶段，这种结构可能更像一个超级基因，具有两个功能性单倍型，进化出一种停止重组的机制，从而保留有益的等位基因变异组合。随着时间的推移，单倍型可能积累了突变（包括结构变化）并逐渐分化到同源性难以检测的程度。考虑到潜在的古老起源，观察到该LSP区域比近期物种形成事件更古老并不意外。在这种情况下，LSP的单倍型可能显示出来自Daphnia属物种间的跨物种多态性信号。

关于易感单倍型长期持久性的可能解释包括波动选择假说，即当P20样寄生虫株因抵抗力的固有成本而稀少时，P20抵抗力的频率下降。另一种假设涉及P20抵抗力的特定成本，即对其他P. ramosa分离株感染的易感性升高。对Daphnia magna-P. ramosa系统的先前研究已表明，感染模式可以遵循匹配等位基因模型；感染只发生在宿主和细菌基因型的特定组合之间。因此，特定的抵抗力等位基因组合将赋予对某些P. ramosa基因型的抵抗力，但以对其他基因型的易感性为代价。这种基因组结构预计会驱动负频率依赖性选择的循环，因为当地适应的P. ramosa种群将选择对抗常见的抵抗力等位基因。

该研究为理解大型结构变异在宿主-寄生虫协同进化中的作用提供了重要见解，展示了如何通过结合长读长测序、群体基因组学和功能分析来解析传统方法难以处理的基因组区域。这些发现不仅推进了对Daphnia-Pasteuria系统遗传架构的理解，也为研究其他生物系统中类似的结构多态性提供了方法论框架。