骨髓增殖性肿瘤患者外周血与骨髓中存在TGF-β特异性T细胞及其靶向巨核细胞祖细胞的研究

《Leukemia》：TGF-β-specific T cells are frequent in peripheral blood and bone-marrow from patients with myeloproliferative neoplasms

本刊推荐：为探究TGF-β在骨髓增殖性肿瘤（MPN）致病中的作用，研究人员开展了TGF-β特异性免疫反应主题研究。结果发现MPN患者外周血和骨髓中存在可识别TGF-β衍生肽段的CD4+ T细胞，并证实巨核细胞祖细胞（MKp）通过共表达HLA-II类分子和TGF-β可作为其靶细胞。该发现为MPN的免疫治疗提供了新靶点。

　　

在血液系统肿瘤的广阔领域中，骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一类起源于造血干细胞（HSCs）的恶性克隆性疾病。这类疾病通常由Janus激酶2（JAK2）、钙网蛋白（CALR）或血小板生成素受体（MPL）基因的驱动突变引发，导致JAK-STAT信号通路异常活化。临床上，MPN主要包括原发性血小板增多症（ET）、真性红细胞增多症（PV）和原发性骨髓纤维化（PMF），其中PMF是疾病的最晚期阶段，预后最差。随着疾病的进展，患者的骨髓微环境会逐渐变得高度炎症化和纤维化，正常的造血功能因此受到严重损害。在这个复杂的病理过程中，转化生长因子-β（TGF-β）被证实是一个关键的介质，它既驱动骨髓纤维化的发生，也导致造血微环境的功能紊乱。

尽管对MPN的分子机制已有一定了解，但免疫系统如何响应这种持续存在的病理信号，特别是针对TGF-β这一关键因子的适应性免疫反应，此前尚不明确。研究人员从其他纤维化疾病（如胰腺导管腺癌，PDAC）中得到启示，在PDAC患者中，强大的TGF-β特异性T细胞反应与患者生存期的延长相关。这促使他们思考：在MPN这种同样以TGF-β驱动的纤维化为特征的疾病中，是否也存在类似的适应性免疫应答？如果存在，这些T细胞能否识别并可能调控表达TGF-β的靶细胞，从而影响疾病进程？为了解决这些问题，来自丹麦哥本哈根大学医院希勒罗德癌症免疫治疗中心等机构的研究团队在《Leukemia》杂志上发表了他们的最新研究成果。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术。他们从健康供者和MPN患者（包括ET、PV、PMF亚型）的外周血和骨髓中分离了单个核细胞（PBMCs和BM-MNCs）。通过体外使用已知能诱导T细胞反应的TGF-β1衍生肽段（TGF-β-15和TGF-β-33）进行刺激，利用基于干扰素-γ（IFN-γ）的酶联免疫斑点技术（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色（ICS）来检测T细胞反应。此外，他们重新分析了一个公开的髓系纤维化患者造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，以探索TGFB1和HLA-II类分子的表达。他们还建立了从MPN患者骨髓CD34⁺细胞向巨核细胞谱系分化的体外模型，并通过流式细胞术、酶联免疫吸附试验（ELISA）以及将分化后的巨核细胞与自体PBMCs共培养后进行ELISPOT检测，来验证巨核细胞的抗原呈递功能和诱导T细胞反应的能力。

TGF-β特异性T细胞在MPN患者外周血和骨髓中的检测

研究人员首先通过体外刺激PBMCs，发现健康供者和MPN患者（ET, PV, PMF）均能对TGF-β-15和TGF-β-33肽段产生T细胞反应。值得注意的是，与健康供者、PV和PMF患者相比，ET患者对TGF-β-15的T细胞反应最为强烈，对TGF-β-33也显示出类似的趋势。通过ICS技术，他们确认这些反应性T细胞为CD4⁺ T细胞，并能产生IFN-γ和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。更重要的是，研究团队在MPN患者的骨髓样本中也成功检测到了TGF-β特异性T细胞的存在。在20例评估的患者中，有16例患者的骨髓单个核细胞（BM-MNCs）在对一种或两种TGF-β肽段的刺激后表现出显著的IFN-γ ELISPOT反应，ICS分析进一步证实了骨髓来源的CD4⁺ T细胞对这两种肽段的特异性反应。与外周血不同的是，骨髓中的反应在不同疾病亚组间没有显示出明显差异。这些发现共同证明了TGF-β特异性CD4⁺ T细胞在MPN患者的外周免疫 compartment 和疾病原发部位——骨髓中均有分布。

巨核细胞祖细胞共表达TGFB1和HLA-II类分子

鉴于TGF-β在MPN骨髓纤维化中的核心作用，以及巨核细胞（MKs）及其祖细胞是TGF-β的主要来源，研究团队接下来探究了这些细胞是否可能成为TGF-β特异性T细胞的靶点。CD4⁺ T细胞的识别需要靶细胞同时表达抗原（这里是TGF-β）和HLA-II类分子。通过对一个包含15例髓系纤维化患者外周血CD34⁺ lineage^- HSPCs的scRNA-seq数据集进行重新分析，他们发现了一个高表达TGFB1的细胞簇（簇3）。该簇细胞同时高表达巨核细胞谱系标志物（如CD41/ITGA2B, CD42b/GP1BA, CD42a/GP9），因此被定义为巨核细胞祖细胞（MKp）。对MKp进行亚聚类分析后，发现在三个亚簇中，有两个亚簇同时表达HLA-II类β链基因（HLA-DRB1, HLA-DPB1）和TGFB1。为了在蛋白水平上验证这一发现，他们检测了四例MPN患者骨髓来源的CD34⁺CD41⁺CD61⁺巨核细胞祖细胞，确认了其表面 robust 的HLA-II类分子表达，并且还检测到了潜伏相关蛋白（LAP，潜伏态TGF-β的标志物）的表达。这些分析结果揭示了在髓系纤维化患者中存在共表达TGFB1和HLA-II类分子的MKps，它们有可能驱动TGF-β特异性CD4⁺ T细胞的活化并被其识别。

体外分化的巨核细胞可诱导TGF-β特异性T细胞反应

为了实验验证上述假设，研究团队将MPN患者骨髓来源的CD34⁺细胞在体外向巨核细胞谱系分化。经过11天的培养，流式细胞术分析显示成功产生了CD41⁺CD61⁺的巨核细胞，其中一部分表达了成熟标志CD42b，并且有相当大比例的CD41⁺CD61⁺细胞共表达HLA-II类分子。对培养上清液的ELISA检测显示，四分之三的供者样本中有可检测到的TGF-β分泌。随后，他们将体外分化的巨核细胞与自体PBMCs共培养，14天后通过ELISPOT检测T细胞对TGF-β肽段的反应。在四名供者中，一名产生了显著的TGF-β-15特异性反应，两名产生了TGF-β-33特异性反应。值得注意的是，产生T细胞反应的两名供者，其巨核细胞培养上清中的TGF-β水平也最高。为了进一步评估巨核细胞呈递TGF-β衍生肽段的能力，研究人员在共培养前用TGF-β-15或TGF-β-33肽段负载巨核细胞。结果发现，在标准共培养中无反应的供者，其肽段负载的巨核细胞能够诱导出强烈的特异性T细胞反应，这证实了巨核细胞具有作为抗原呈递细胞并诱导TGF-β特异性T细胞反应的能力。

本研究首次在骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者的外周血和骨髓中证实了TGF-β特异性CD4⁺ T细胞的存在，并鉴定出共表达TGFB1和HLA-II类分子的巨核细胞祖细胞（MKps）是其潜在的靶细胞。这些T细胞可能是在骨髓慢性炎症环境中，为响应持续高水平的TGF-β而扩增的适应性免疫反应的一部分。通过识别并可能作用于表达TGF-β的细胞（如MKps、间充质基质细胞和髓系单核细胞），TGF-β特异性T细胞或许能够限制由TGF-β介导的促纤维化信号，从而可能减缓骨髓纤维化的进程和MPN疾病的进展。研究发现ET患者（疾病早期）的TGF-β特异性T细胞反应强于PMF患者（疾病晚期），提示在疾病进展过程中可能存在抗原特异性T细胞耗竭。这为治疗干预的时机提供了重要线索：在疾病早期激活这些T细胞可能更有效。

该研究的发现具有重要的治疗意义。基于TGF-β的免疫调节疫苗（IMV）在同样以纤维化为特征的胰腺导管腺癌（PDAC）小鼠模型中已显示出抗肿瘤和抗纤维化功效。因此，评估TGF-β导向的IMV在MPN中的应用具有充分的理由。然而，考虑到晚期疾病中可能存在的T细胞耗竭，在疾病早期进行疫苗接种可能至关重要。此外，采用携带TGF-β特异性T细胞受体（TCR）的过继性TCR-T细胞疗法，是另一种值得探索的补充策略。

总之，这项研究揭示了MPN中一种此前未知的、针对疾病核心致病因子TGF-β的适应性免疫应答，为开发针对MPN，特别是其纤维化并发症的新型免疫治疗方法奠定了坚实的基础，指明了潜在的作用靶点和干预时机。