柑橘绿木霉（Trichoderma citrinoviride）对多种植物病原真菌的生物防治潜力：体外评估与机制研究

《Scientific Reports》：Bioefficacy of Trichoderma citrinoviride against some plant pathogenic fungi

本刊推荐：为解决化学农药滥用导致的病原菌抗性、环境残留及非靶标危害等问题，研究人员开展了“柑橘绿木霉（Trichoderma citrinoviride）对多种植物病原真菌的生物防治潜力”研究。通过体外双重培养、挥发性/非挥发性代谢物测定及玻片培养等实验，发现该菌株对Alternaria sp.、Fusarium sp.等5种病原菌均表现出显著抑制效果（最高抑制率达80.95%），并证实其具有强效菌寄生作用。该研究为开发新型绿色农用制剂提供了重要菌种资源与理论依据。

　　

在全球农业生产中，真菌病害如同隐形的收割者，持续威胁着粮食安全与作物健康。据估计，植物病害每年导致全球作物损失高达20%-40%，其中真菌病原体是主要元凶。长期以来，化学杀菌剂被视为控制病害的首选手段，但其过度使用已引发一系列严峻问题：病原菌抗药性日益普遍，土壤微生态遭到破坏，农药残留通过食物链进入人体，甚至对非靶标生物造成危害。面对这些挑战，寻求环境友好、可持续的病害防控策略已成为现代农业科学的迫切任务。

在这一背景下，生物防治——利用有益微生物及其代谢产物抑制病原菌——展现出巨大潜力。其中，木霉属（Trichoderma）真菌因其广谱的抗病原菌活性、强大的环境适应能力以及促进植物生长的特性，被视为最有应用前景的生防因子之一。木霉菌通过多种机制发挥生防作用，包括营养与空间竞争、产生抗菌代谢物、菌寄生（mycoparasitism）以及诱导植物系统抗性等。值得注意的是，木霉菌能够产生丰富的次生代谢产物，包括挥发性有机化合物（VOCs）和非挥atile代谢物（如肽醛类、聚酮类等），这些物质在抑制病原菌生长方面扮演着关键角色。

在木霉属的众多物种中，柑橘绿木霉（Trichoderma citrinoviride）属于长枝木霉支系（longibrachiatum clade），在临床和生态学上均具有重要意义。已有研究表明该物种对多种植物病原菌具有生防潜力，但不同地理来源的菌株其抗病原菌活性和代谢物谱可能存在显著差异。因此，对特定地方菌株进行系统评估，对于开发适用于当地农业系统的生防制剂至关重要。

发表在《Scientific Reports》的这项研究，旨在全面评估也门萨那大学微生物实验室保藏的一株本地柑橘绿木霉菌株（AUMIC 13831）对五种常见植物病原真菌（Alternaria sp.、Aspergillus sp.、Colletotrichum sp.、Fusarium sp. 和 Rhizoctonia sp.）的体外抗真菌活性。研究人员通过多种实验方法系统探究了该菌株的生防潜力与作用机制。

本研究主要采用了双重培养法（评估直接竞争和抗作用）、非挥发性代谢物测定（评估培养滤液中的可溶性抑菌物质）、挥发性代谢物测定（评估气体扩散性抑菌物质）以及玻片培养法（显微镜下直接观察菌寄生现象）等关键技术方法。供试病原菌来源于当地患病植物组织分离株。

结果

双重培养法测定T. citrinoviride的抗真菌活性

双重培养实验表明，T. citrinoviride能有效抑制所有供试植物病原真菌的菌丝生长，抑制率存在差异。最易感的是Colletotrichum sp.（抑制率61.29% ± 1.86），其次是Alternaria sp.（57.14% ± 0.01）、Fusarium sp.（51.16% ± 0.05）和Rhizoctonia sp.（50.88% ± 0.73）。T. citrinoviride对Aspergillus sp.的拮抗活性最低（28.57% ± 0.32）。根据Bell氏分级标准，T. citrinoviride对除Alternaria sp.（Class 1，完全覆盖培养基表面）外的所有测试病原菌均被评为Class 2（覆盖约四分之三的培养基表面）。

非挥发性代谢物的作用

T. citrinoviride的培养滤液对供试植物病原真菌产生了显著的抑制圈。对Fusarium sp.的抑制率最高（80.95% ± 0.92），其次为Colletotrichum sp.（69.62% ± 0.72）、Rhizoctonia sp.（61.43% ± 0.97）和Aspergillus sp.（50% ± 1.05）。T. citrinoviride对Alternaria sp.的抑制率最低（48.21% ± 0.45）。这表明非挥发性代谢物是T. citrinoviride最主要的抑菌机制之一。

挥发性代谢物的作用

T. citrinoviride产生的挥发性代谢物能有效抑制病原菌菌丝生长，对Alternaria sp.的抑制率最高（36.36% ± 0.43），其次为Fusarium sp.（29.31% ± 0.42）、Colletotrichum sp.（23.29% ± 0.69）和Rhizoctonia sp.（20.51% ± 0.74）。对Aspergillus sp.的抑制率最低（16% ± 0.50）。挥发性代谢物的抑菌效果总体上低于非挥发性代谢物。

玻片培养法

显微镜观察清晰地揭示了T. citrinoviride对所有检测病原真菌的菌寄生活性。观察到了菌寄生相互作用的连续阶段，包括菌丝粘附、缠绕宿主菌丝、穿透宿主细胞壁以及随后病原真菌结构的裂解。在菌丝重叠区域，T. citrinoviride保持均匀且组织良好的菌丝形态，而病原真菌则表现出明显的结构紊乱，菌丝破裂、碎片化和变形，显示出广泛的细胞损伤。病原菌菌丝细胞壁降解和细胞质崩解的证据证实了T. citrinoviride强大的拮抗潜力。

讨论与结论

本研究通过多种体外测定方法，证实本地分离的T. citrinoviride菌株（AUMIC 13831）对多种重要植物病原真菌具有广谱且显著的抗真菌活性。非挥发性代谢物表现出最强的抑菌效果，表明抗生素作用（antibiosis）是该菌株的主要生防机制。挥发性代谢物和直接竞争（双重培养）也贡献了抑菌效果。显微镜观察为直接的菌寄生作用提供了确凿证据，展示了包括菌丝粘附、缠绕、穿透和裂解在内的完整过程。

不同病原菌对T. citrinoviride拮抗作用的敏感性差异，可能与其固有的防御机制有关，如细胞壁结构、黑色素化程度以及菌核等抗逆结构的形成。本研究结果与先前关于T. citrinoviride及其他木霉物种具有强大拮抗潜力的报道一致。

综上所述，T. citrinoviride AUMIC 13831展现出作为多种植物病害可持续管理生物防治剂的巨大潜力。其强大的抑菌活性，特别是通过非挥发性代谢物介导的活性，以及观察到的菌寄生能力，共同构成了其多方面的生防机制。然而，本研究仅限于体外实验，其结果尚不能直接外推至复杂的田间环境。未来的研究需要包括温室和田间试验（植物体内验证），以确认其实际应用效果；进行毒理学和环境安全性评估，确保其使用安全；并利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）等技术明确鉴定其活性次生代谢物的化学结构，为开发基于T. citrinoviride的高效、安全商业生物农药奠定坚实基础。