赞比亚儿童腹泻病例中G3和G12型人类轮状病毒占主导：基于病原体聚焦宏基因组学的基因监测研究

《Scientific Reports》：Pathogen-focused metagenomic analysis reveals predominance of human rotavirus genotypes G3 and G12 in Zambian pediatric diarrhea cases

本研究针对赞比亚2023年腹泻监测中采集的样本，采用VirCapSeq-VERT技术进行病原体聚焦宏基因组分析，揭示了G3和G12型人类轮状病毒在赞比亚儿科腹泻病例中的优势流行。研究发现70株病毒具有近乎完整的基因组，存在Wa-like、DS-1-like基因群和重配株，并鉴定出VP3基因型M5，提示可能存在动物源性传播。抗原表位分析显示流行株与疫苗株存在关键氨基酸差异，可能影响疫苗效力。该研究强调了基因组监测对于评估疫苗效果和制定公共卫生策略的重要性。

　　

在公共卫生领域取得长足进步的今天，轮状病毒（Rotavirus）相关的腹泻疾病，在低收入和中等收入国家（LMICs）的儿童中，依然是导致显著发病率和死亡率的重要原因。尽管全球在改善水卫生条件和推广轮状病毒疫苗接种方面取得了进展，但轮状病毒胃肠炎对五岁以下儿童的健康威胁依然严峻。这种持续存在的挑战，部分归因于轮状病毒本身极高的基因多样性，其背后的驱动力包括病毒基因组分节段特性导致的频繁重配（reassortment），以及RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）缺乏校对功能所引发的点突变。此外，人畜共患传播也被认为是推动轮状病毒多样性的另一个关键因素。为了评估疫苗效力并检测可能出现的免疫逃逸变异株，持续的基因组监测变得至关重要。

在此背景下，由Innocent Mwape、Suwilanji Silwamba、Michelo Simuyandi等研究人员领导的一项新研究，对赞比亚2023年腹泻监测期间轮状病毒的遗传多样性进行了深入分析。这项研究发表在《Scientific Reports》上，采用了先进的VirCapSeq-VERT（VCS）技术，揭示了赞比亚儿科腹泻病例中人类轮状病毒基因型G3和G12的优势流行，并发现了可能与免疫逃逸和动物传播相关的关键基因组特征。

研究人员为开展此项研究，主要运用了几个关键技术方法。首先，研究设计为横断面调查，于2023年从赞比亚九个省的医疗机构收集了245份五岁以下腹泻儿童的粪便样本。实验室核心流程包括：使用商业化的多重qPCR试剂盒进行轮状病毒初筛（Ct值<33的72份阳性样本用于后续分析）；通过自动化平台提取总核酸（TNA）；利用VirCapSeq-VERT技术进行文库制备和病毒序列捕获富集；最后在Illumina NextSeq2000平台上进行高通量测序。生物信息学分析依托RIM（Rapid Identification of Microbes）流程，进行质量过滤、去宿主、从头组装、BLAST比对和基因分型（使用在线轮状病毒基因分型工具），并对VP7、VP4和VP3基因进行系统发育分析。统计方面，对参与者人口统计学特征按疫苗接种状态进行分组比较，并分析了基因型与疾病严重度（基于Vesikari评分）的分布关联。

Participant Characteristics

研究共纳入72名参与者，按轮状病毒疫苗接种状态分为四组：完全接种（38人）、单剂接种（9人）、未接种（7人）和信息缺失（18人）。统计分析显示，在疾病严重程度（Vesikari评分）上，各组存在显著差异（p = 0.033）。完全接种组的参与者表现出轻度症状的比例更高（55%），而单剂接种组和未接种组分别为11%和29%。严重病例在完全接种组中较少见（18%），而未接种组为29%。在就诊结果方面，完全接种组（58%）和单剂接种组（56%）立即出院的比例高于未接种组（43%），但差异未达到统计学显著性（p = 0.056）。这些发现提示，完成全程疫苗接种可能与较轻的疾病严重程度相关。

Rotavirus Genotypes

生物信息学分析显示，72株qPCR阳性样本中有70株获得了近乎完整的基因组。基因群分析显示，45株为Wa-like基因群，11株为DS-1-like基因群，14株为重配株。VP7和VP4分析揭示了多样的基因型（G1-G3, G8-G9, G12; P[4], P[6], P[8], P[11]）。其中，G3和G12基因型与P[4]、P[6]和P[8]组合是最主要的基因型（分别为35/70和13/70）。特别值得注意的是，发现了一株在Wa-like和DS-1-like基因群间存在四个基因片段交换的重配株（G3-P[4]-I1-R2-C2-M1-A1-N1-T2-E2-H2），以及九株携带M5基因型的VP3毒株。

Phylogenetic analysis of VP7, VP4 and VP3

系统发育分析显示，赞比亚的10株G1毒株与来自印度和卢旺达的毒株聚簇，核苷酸同源性为98%，但与Rotarix疫苗的G1株分开。唯一的G2毒株与俄罗斯和莫桑比克的毒株聚簇，同源性为97-99%。27株赞比亚G3毒株与俄罗斯、美国毒株以及RotaTeq疫苗来源的G3株具有92-97%的核苷酸同源性，另有8株G3与美国和南非的毒株（部分为猴源）聚簇，同源性为91.2%。9株G8毒株与坦桑尼亚、肯尼亚和乌干达的毒株聚簇，同源性为98-99%。2株G9赞比亚毒株与Rotavac疫苗株具有99%的核苷酸同源性。VP4基因分析表明，所有40株赞比亚P[8]毒株与先前分离的赞比亚毒株（OR338270）及一株印度毒株具有99%同源性。14株P[4]毒株与马拉维、俄罗斯和先前赞比亚毒株具有98-99%同源性。14株P[6]毒株与比利时和美国毒株聚簇。2株P[11]毒株与Rotavac疫苗株及印度P[11]毒株聚簇，同源性为99%。VP3基因分析显示，多数赞比亚毒株属于M1谱系，与马拉维和莫桑比克毒株同源性为98-99%；另外13株属于M2谱系，与南非、肯尼亚和坦桑尼亚毒株同源性最高（98-99%）；值得注意的是，有9株毒株属于M5亚簇，与猴源毒株DQ838645的最大核苷酸同源性为91%。

Rotavirus VP7 Neutralizing Epitopes with Vaccine Strains

VP7蛋白抗原表位（包含7-1a, 7-1b, 7-2三个亚区）比对显示，疫苗株与赞比亚野生株（G1, G2, G3, G8, G12）之间存在氨基酸差异。在29个表位氨基酸中，有6个（T91, W98, Q104, K291, Q201, G264）在疫苗株和野生株之间完全保守。相比之下，G2和G12基因型与疫苗株的差异最大，分别有14个和14个氨基酸不同，其中已知可导致单克隆抗体中和逃逸的位点分别有7个（G2）和8个（G12）。G1与疫苗株之间仅发现2个氨基酸差异。

Rotavirus VP4 Neutralizing Epitopes with Vaccine Strains

VP4蛋白的抗原表位（包括VP8的8-1, 8-2, 8-3, 8-4和VP5的5-1, 5-2, 5-3, 5-4, 5-5）分析显示，在37个表位氨基酸中，有12个在疫苗株和赞比亚野生株（P[4], P[6], P[8], P[11]）之间完全保守。按基因型比较，P[6]的氨基酸差异数量最多（13/37），其次是P[4]（8/37），P[8]的差异最少（2/37）。两株赞比亚P[11]基因型与Rotavac疫苗株之间未发现差异。

Rotavirus Genotypes Across Vesikari Score Severity Categories

轮状病毒基因型的分布在不同的Vesikari评分严重程度类别（轻度、中度、重度）中有所不同。在轻度病例中，G12P[8]是主要基因型（8/26, 30.8%），其次是G3P[8]（6/26, 23.1%）和G1P[8]（3/26, 11.5%）。相比之下，重度病例以G3P[8]基因型为主（8/13, 61.5%），表明其基因型多样性低于轻度和中度组。中度病例表现出最高的多样性，基因型分布更为均衡，包括G3P[8]（7/31, 22.6%）、G8P[4]（7/31, 22.6%）、G1P[8]（5/31, 16.1%）和G3P[4]（2/31, 6.5%）。G2P[4]仅存在于中度组中。

研究的讨论与结论部分强调了多个重要发现及其意义。首先，研究确认了G3和G12基因型在赞比亚儿童中的优势地位，这与COVID-19大流行后疫苗供应中断以及赞比亚在2022年底从Rotarix^TM转向Rotavac^TM的全国性疫苗转换时期相吻合。其次，研究揭示了显著的基因多样性，这主要由Wa-like基因群1和DS-1-like基因群2毒株之间的重配事件以及种间传播驱动。特别重要的是，在VP3基因中鉴定出的M5基因型（共9株），与猴轮状病毒高度相似，提示存在人畜共患传播和种间重配的可能性，这凸显了在人类与动物接触密切的非洲地区，轮状病毒进化的动态性。第三，抗原表位分析发现，当地流行的G2、G3和G12毒株的VP7和VP4蛋白关键抗原位点，与赞比亚使用的疫苗株（Rotarix和Rotavac）存在显著的氨基酸错配，其中多个位点已知可导致中和抗体逃逸。这从基因层面为轮状病毒疫苗在赞比亚等中低收入国家有效性相对较低的现象提供了可能的解释。此外，研究首次在赞比亚两名腹泻儿童中检测到Rotavac疫苗株，其来源可能与疫苗接种后排泄或自然传播有关，并且病例均存在其他病原体（如HHV-6、爱知病毒、诺如病毒等）的合并感染。最后，对疫苗接种状态与疾病严重程度的关联分析表明，完成全程疫苗接种的儿童发生轻度疾病的比例显著更高，提示全程接种对预防严重疾病具有保护作用。

综上所述，这项研究利用病原体聚焦宏基因组学方法，详细描绘了赞比亚儿童腹泻病例中轮状病毒的基因特征和进化动态。研究结果强调了持续进行轮状病毒基因组监测的必要性，以追踪毒株演变、评估疫苗效果（尤其是在疫苗转换后），并为公共卫生策略的调整提供关键信息。研究中采用的qPCR结合泛病毒病原体聚焦宏基因组学的两步分子诊断策略，具有同时获得轮状病毒完整基因特征和识别合并感染的优势，为未来的病原监测提供了有价值的范本。该研究也指出了当前研究的局限性，如未能涵盖其他肠道病原体的潜在贡献、部分参与者疫苗接种日期缺失、样本量限制以及对免疫逃逸的预测主要基于生物信息学分析而缺乏功能性实验验证等，这些均为未来的研究方向指明了道路。