主要组织相容性复合体II类分子在小鼠抗原呈递细胞中被K11和K63分支泛素链修饰的机制研究

《Scientific Reports》：Major histocompatibility class II in murine antigen presenting cells is modified with a branched K63 and K11-linked ubiquitin chain

本研究针对MHC II（主要组织相容性复合体II类分子）在适应性免疫中的关键调控机制展开深入探索。研究人员通过质谱分析和创新的Ub"clipping"蛋白质组学技术，首次在原发性小鼠抗原呈递细胞（cDCs和B细胞）中揭示了MARCH1依赖的MHC II多聚泛素链由K11和K63分支连接组成。这一发现不仅阐明了MHC II泛素化的精确分子机制，更为调控适应性免疫中MHC II功能提供了新的靶点。

　　

在免疫系统的精密调控网络中，主要组织相容性复合体II类分子（MHC II）犹如一座桥梁，连接着先天免疫和适应性免疫。它负责将外源性抗原呈递给CD4⁺ T细胞，从而启动特异性免疫应答。然而，MHC II的表达和功能受到严格调控，其中泛素化修饰扮演着关键角色。泛素化如同给蛋白质贴上"标签"，决定其在细胞内的运输路线和最终命运。

尽管已知MHC II的细胞内运输和降解受泛素化调控，且这一过程由E3泛素连接酶MARCH1介导，但多年来，与MHC II相关的多聚泛素链的具体组成和结构一直是个谜。这种泛素"密码"的未知，限制了我们深入理解MHC II的调控机制，也阻碍了针对该通路开发精准免疫调控策略的可能性。

为了解开这一谜团，来自墨尔本大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新发现。他们首次在原发性免疫细胞中全面表征了与MHC II相关的多聚泛素链，揭示了其独特的分支结构，这一发现不仅深化了对MHC II调控机制的理解，也为免疫相关疾病的治疗提供了新思路。

研究人员主要运用了几项关键技术：从C57BL/6和BALB/c小鼠脾脏中分离常规树突状细胞（cDCs）和B细胞；通过免疫沉淀获取内源性MHC II蛋白；采用UbiCREST assay（泛素链限制性分析）进行泛素链连接类型初步鉴定；利用质谱绝对定量（Ub-AQUA）技术精确定量不同连接类型的泛素链；应用创新的Lbpro*蛋白酶"clipping"技术结合完整蛋白质质谱分析泛素链分支结构。

MARCH1泛素化cDCs和B细胞中的I-A和I-E

研究人员首先证实了MARCH1对不同MHC II同种型的泛素化作用。通过流式细胞术分析发现，缺乏MARCH1的B细胞表面MHC II表达增加，这表明MARCH1泛素化不仅作用于I-A^b单倍型，也作用于I-A^d单倍型。更重要的是，他们首次证实I-E^d在cDCs和B细胞中也被泛素化，且这一过程同样依赖MARCH1。

UBE2D2/3而非UBE2S或UBE2N E2泛素连接酶调控MHC II质膜表达

为了寻找与MARCH1协作的E2泛素连接酶，研究人员在Mutu DC细胞中进行了筛选。结果显示，UBE2D2/3的缺失会导致MHC II表面表达增加，但这种效应并不伴随MHC II泛素化水平的显著变化，表明UBE2D2/3可能通过泛素化非依赖的间接机制调控MHC II表面周转。

原发性脾脏B细胞和cDCs中MHC II I-A^b泛素链包含K11和K63泛素链连接

通过UbiCREST assay初步分析发现，AMSH（特异性切割K63连接）处理可消除大部分MHC II泛素化，提示K63连接的存在。随后，利用更敏感的质谱绝对定量技术，研究人员检测到MHC II免疫沉淀物中存在K11、K48和K63连接的泛素链特征肽段。在MARCH1缺失的细胞中，K11和K63连接的泛素信号显著降低，表明这些连接特异性依赖于MARCH1。

原发性cDCs中MHC II I-A^b被分支泛素链修饰

由于MHC II I-Aβ链仅在K225一个位点被泛素化，但检测到多种连接类型，这表明泛素链可能具有分支结构。通过Lbpro*"clipping"技术和完整蛋白质质谱分析，研究人员量化了三种泛素物种："末端帽"（Ub△GG，占46.7%）、"线性链"（Ub△GG+1×GG，占34.4%）和"分支链"（Ub△GG+2×GG，占18.9%）。这一结果确凿地证明了MHC II相关泛素链中存在分支结构。

本研究首次在原发性抗原呈递细胞中全面揭示了MHC II相关多聚泛素链的组成和结构特征。研究发现，MARCH1介导的MHC II泛素化不仅存在于I-A，也存在于I-E同种型，且这一过程产生的泛素链是由K11和K63连接组成的分支结构，其中约19%的泛素单体以"分叉"形式存在。

这一发现具有多重重要意义：首先，这是对MARCH E3泛素连接酶在原发性细胞中产生的泛素链的首次描述，为了解这类重要酶的功能特性提供了关键信息；其次，分支泛素链的发现为理解MHC II的精细调控机制开辟了新视角，这种特殊结构可能通过增强泛素信号、抵抗去泛素化酶（DUBs）切割或改变与内化适配器的亲和力等方式，更有效地调控MHC II的内化和降解。

分支泛素链的研究是泛素密码领域的前沿课题，其在细胞表面受体内化过程中的作用尤为少见。该研究不仅为免疫学家提供了重要分子机制见解，也为泛素生物学领域贡献了宝贵案例。未来研究可进一步探索K11和K63分支泛素链的具体功能机制，以及如何针对这一特殊结构开发免疫调控策略，为感染、自身免疫病和癌症等疾病的治疗提供新思路。