tRNA依赖性构象动力学与折叠协同调控全长T-box核糖开关的翻译机制

《Nature Communications》：tRNA-dependent conformational dynamics and folding coordinate translational regulation by a full-length T-box riboswitch

本刊推荐：为阐明T-box核糖开关如何通过动态构象变化区分tRNA氨基酰化状态这一机制难题，研究人员开展了全长结核分枝杆菌ileS T-box的单分子FRET研究，发现其通过"构象选择"机制实现分步tRNA识别，其中GAG接头（特别是G96）是感知tRNA 3‘-末端的关键分子枢纽，该研究为理解共转录折叠与翻译调控耦合机制提供了新范式。

　　

在细菌的基因调控网络中，T-box核糖开关是一类独特的核糖调节因子，它能够通过感知tRNA的氨基酰化状态来精确调控氨基酸代谢相关基因的表达。这类RNA元件广泛存在于革兰氏阳性菌中，包括多种致病菌，但由于其不存在于人类细胞中，因此成为潜在的抗菌药物靶点。典型的T-box核糖开关采用模块化结构设计，包含5‘端的解码结构域（茎I、II和IIA/B）和3’端的鉴别结构域（茎III和反终止子/反隔离子），两者通过单链接头区域连接。其中，茎I的识别环负责特异性结合tRNA的反密码子，而鉴别结构域则能够感知tRNA 3‘-末端NCCA的氨基酰化状态，进而通过反终止子（AntiT）与终止子（Terminator）或反隔离子（AntiS）与隔离子（Sequestrator）之间的构象转换，实现对下游基因的转录衰减或翻译起始调控。

尽管近年来通过X射线晶体学技术获得了多个T-box核糖开关与tRNA配体复合物的高分辨率结构，但这些结构仅提供了截短版本T-box在结合状态下的静态快照。对于一个全长T-box核糖开关在未结合状态下的结构信息，以及tRNA结合如何诱导其构象动态变化从而实现基因调控的机制，仍然知之甚少。特别值得注意的是，tRNA的识别、结合和氨基酰化状态鉴别是一系列高度动态的过程，而RNA在转录过程中即开始折叠的特性，为阐明T-box核糖开关在结合氨基酰化或未氨基酰化tRNA时的结构动力学增加了额外复杂性。

近期，张实验室和Ke实验室分别提出了关于T-box核糖开关区分tRNA氨基酰化状态的不同模型。张实验室认为鉴别结构域具有刚性结构，能够通过空间位阻排斥氨基酰化的tRNA；而Ke实验室则认为鉴别结构域具有构象灵活性，能够容纳甚至结合已氨基酰化的tRNA，但这种结合会破坏驱动AntiS形成的三级相互作用，从而有利于形成隔离子（Sequestrator）构象。尽管两种模型都有相应的生化和结构证据支持，但tRNA氨基酰化状态鉴别的真实机制仍不清楚，需要进一步研究。

为了解决这些关键问题，清华大学和中国科学院生物物理研究所联合研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果，题为“tRNA-dependent conformational dynamics and folding coordinate translational regulation by a full-length T-box riboswitch”。该研究利用基于NaM-TPT3非天然碱基对（UBP）系统的位点特异性荧光标记新方法，结合单分子FRET（smFRET）技术，系统描绘了结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）全长翻译性ileS T-box核糖开关在应答不同3‘-末端tRNA时的局部和全局结构动力学，揭示了tRNA依赖性构象动力学与折叠如何协同调控其翻译起始的精细机制。

研究团队采用了多项关键技术方法：利用非天然碱基对系统实现RNA内部位点特异性荧光标记，使全长RNA分子的单分子FRET分析成为可能；通过单分子FRET技术实时监测T-box核糖开关在不同状态下的构象动态变化；使用小角X射线散射（SAXS）分析复合物的全局结构和紧凑度；采用电泳迁移率变动分析（EMSA）验证RNA与tRNA的结合特性；通过构建不同长度的RNA转录本模拟共转录折叠中间体，研究共转录调控机制。

核心T-box通过分步tRNA结合形成不同复合物

研究人员首先通过电泳迁移率变动分析（EMSA）和小角X射线散射（SAXS）研究了核心T-box（T166）与不同tRNA构建体的结合特性。发现核心ileS T-box在未结合状态下构象灵活，不能正确折叠，而与未氨基酰化tRNA（tRNAIle）结合后形成稳定紧凑的复合物。有趣的是，模拟氨基酰化tRNA的tRNA78也能与T-box形成复合物，但其结构更加动态且不够稳定。通过smFRET分析发现，tRNA78的3‘-末端与T166 AntiS的解离速度（0.82 s^-1）远快于tRNAIle（0.27 s^-1），表明氨基酰化tRNA的第二位点相互作用更加动态且不稳定。

核心T-box解码结构域的结构动力学

通过比较结核分枝杆菌和诺卡氏菌（Nocardia farcinica）T-box解码结构域的smFRET分析，发现虽然两者二级结构高度同源，但分子识别机制存在差异。结核分枝杆菌ileS T-box的解码结构域在未结合状态下即存在构象异质性，同时采样开放（未对接）和闭合（对接）构象，而第一步的识别环-反密码子结合（不依赖于tRNA 3‘-末端氨基酰化状态）增强了闭合构象的种群。这表明M. tub ileS T-box以构象选择机制识别其同源tRNA，不同于N. far ileS T-box的诱导契合机制。

核心T-box鉴别结构域的结构动力学

为了绘制核心T-box鉴别结构域及邻近区域在分步tRNA结合过程中的构象变化，研究人员表征了三个T166标记构建体与不同氨基酰化状态tRNA的复合物。研究发现，接头区域在未结合状态下即具有动态性和灵活性，而未氨基酰化tRNA（tRNAIle）的双位点结合能强烈稳定完全结合构象。相反，在氨基酰化tRNA（tRNA78）存在下，接头区域变得更加灵活，不再稳定在完全结合构象中。同时，茎III在氨基酰化tRNA结合时会远离AntiS的底部螺旋，而AntiS结构域的折叠对tRNA 3‘-末端氨基酰化状态不太敏感。

接头区域在tRNA 3‘-末端鉴别中的作用

通过分析单点突变体（G94U和G96C）以及缺失突变体（Δ88-93），研究发现G96在识别tRNA氨基酰化状态中起关键作用。G96C突变完全丧失了3‘-末端鉴别能力，其与tRNAIle或tRNA78形成的复合物构象相似，而G94U和Δ88-93突变仅产生轻微影响。这表明G96是感知tRNA氨基酰化状态的关键核苷酸，通过与AntiS结构域形成特异的长期碱基配对相互作用（与C131），在区分tRNA氨基酰化状态中发挥核心作用。

全长T-box对tRNA 3‘-末端识别的共转录调控

研究表明，全长ileS T-box核糖开关（T229）在体外合成后主要采用隔离子构象，这种构象由于高能垒而削弱了对tRNA NCCA 3‘-末端的识别。通过比较不同长度T-box构建体（T166、T209、T215、T229）的smFRET分析，发现随着转录本长度增加，转录后合成的T-box对tRNA NCCA 3‘-末端的识别敏感性降低。然而，当在转录过程中同时存在tRNA时，共转录合成的T229/tRNAIle复合物显示出更窄的FRET直方图，中FRET状态（E~0.6）更加显著，表明T229的折叠受到共转录识别和tRNA NCCA 3‘-末端结合的调控。

研究结论与讨论部分强调，该研究通过基于NaM-TPT3非天然碱基对的位点特异性标记策略，首次在单分子水平全面描绘了全长翻译性T-box核糖开关的动态调控机制。研究发现结核分枝杆菌ileS T-box通过构象选择机制实现分步tRNA识别，其中G96是感知tRNA氨基酰化状态的关键分子枢纽。更重要的是，研究揭示了翻译性T-box核糖开关的折叠和tRNA识别是共转录调控的，只有在AntiS结构域被转录但SD序列尚未转录时，tRNA NCCA 3‘-末端才能有效结合T-box。这一发现为理解RNA在转录过程中的动态折叠与功能实现提供了重要见解。

该研究的重要意义在于不仅阐明了T-box核糖开关的动态调控机制，而且建立的NaM-TPT3非天然碱基对标记策略为长链RNA的单分子研究提供了强大工具，有望在天然延伸复合物中制备标记RNA，用于共转录研究。这些发现对理解RNA中心的调控机制以及开发RNA靶向疗法具有重要价值，特别是考虑到T-box核糖开关在病原菌中广泛存在而在人类中缺失的特点，使其成为有前景的抗菌药物靶点。