突触蛋白质组多样性受谷氨酸受体及其调控蛋白水平调控的新机制

《Nature Communications》：Synaptic proteome diversity is shaped by the levels of glutamate receptors and their regulatory proteins

本研究针对微观脑区突触蛋白质组分析的技术瓶颈，开发了结合激光捕获显微切割和蛋白质组学的新方法，首次系统解析了海马三突触回路中不同突触类型的蛋白质组差异。研究发现突触功能多样性主要由共享蛋白的表达量差异驱动，特别是谷氨酸受体及其调控蛋白的表达水平受神经元特异性基因表达程序调控，揭示了突触蛋白质组多样性的新型分子机制。

　　

在我们的大脑中，突触是神经元之间信息传递的关键结构，不同类型的突触具有独特的功能特性。然而，由于技术限制，科学家们一直难以对局限于微观脑区的特定突触类型进行蛋白质组学分析，这严重阻碍了我们对突触功能分子基础的理解。

传统蛋白质组学研究需要相对较大的脑区样本，如整个海马体或新皮层，但这些脑区包含许多不同的突触类型，因此只能揭示"平均"突触的组成。要想真正理解突触功能状态的分子调控机制，必须对单个突触类型进行研究。这是精确阐明大脑功能分子机制的最重要技术障碍。

为了解决这一挑战，由Rita Reig-Viader、Diego del Castillo-Berges、Albert Burgas-Pau和Daniel Arco-Alonso等共同第一作者领导的研究团队开发了一种创新方法，能够在微观脑区水平分析突触蛋白质组。他们应用这一方法研究了小鼠海马体三突触回路中突触的分子多样性，相关成果发表在《Nature Communications》期刊上。

关键技术方法概述

本研究主要采用激光捕获显微切割技术从海马体特定层（CA1-辐射层、CA3-透明层、齿状回-分子层）收集神经纤维网样本，结合优化的突触蛋白提取方法（1% Triton X-100处理、超声破碎和热激）富集突触蛋白。通过液相色谱-串联质谱进行深度蛋白质组分析，使用Scaffold-DIA和Progenesis QI进行蛋白鉴定和定量，MSqROB进行差异表达分析。同时整合Allen脑图谱的原位杂交和单细胞RNA测序数据，利用pathfindR进行通路富集分析，并应用随机森林算法评估突触基因在神经元类型分类中的贡献。

突触蛋白从微观脑区的分离

研究人员开发了一种结合激光捕获显微切割和突触蛋白增强提取的新流程。该方法首先快速冷冻前脑并制备10微米厚的冠状切片，专门收集包含背侧海马体前500微米的区域。通过视觉区分含细胞体的层状结构并排除，仅收集富含突触的神经纤维网。

从齿状回获取分子层，从CA3获取透明层，从CA1获取辐射层。研究人员建立了最大切片厚度为10微米以实现有效激光切割，通过解剖100微米宽度的碎片来控制获取的海马层。估计从CA1辐射层、CA3透明层和齿状回分子层收集的组织分别占整个海马体的8%、6%和7%。

从激光捕获显微切割收集的微量组织中提取突触蛋白极具挑战性。为了解决这一限制，研究人员开发了一种程序，旨在最小化样本操作，减少样本损失，同时最大化突触蛋白的回收率。微解剖组织在含有1% Triton X-100的溶液中积累，然后进行三步处理：短暂水浴超声、35°C振荡温和热激和第二次超声。该程序完全分散神经纤维网碎片，最大化去污剂效果，同时保持蛋白质完整性并避免样本操作。最终离心收集Triton不溶性蛋白。

通过免疫印迹检测主要可溶性蛋白和主要不溶性蛋白，验证了该程序的有效性。超过90%的Psd95信号在沉淀中检测到，相反，相同比例的Syp在上清液中。样品间Psd95丰度无差异，表明该程序在所有海马层具有相似效率。

由于这些样本含有很少的蛋白质，无法使用标准蛋白质定量方法。通过电泳法定量蛋白质浓度，使用准确量化的海马突触制备物作为内部校准标准。确定不溶性部分含有组织中约20%的所有蛋白质，表明这些部分中的蛋白质浓缩了4-5倍。

三突触回路突触组成的高度相似性

使用上述流程，研究人员从三突触回路的层中获得了突触制备物的生物学三重样本，并对其进行蛋白质组学分析。MS/MS数据用Scaffold-DIA检查以鉴定蛋白质标本，用Progenesis QI进行肽段定量。肽段丰度通过14种突触支架蛋白的肽段平均丰度进行标准化，从而校正制备物间突触产量和层间突触密度的差异。最后，使用MsqROB鉴定突触类型间差异表达的蛋白质。

将从微解剖组织获得的蛋白质组数据集与参考蛋白质组进行比对。参考蛋白质组由通过差速超速离心制备的两个海马突触部分的蛋白质组组合生成。在激光捕获显微切割样本中检测到但参考蛋白质组中缺失的蛋白质被丢弃为污染物。对丢弃蛋白质中突触位置和生物过程过度表征的分析仅返回一个显著突触位置和没有显著生物过程，表明比对服务达到了从突触制备物中去除污染物的目的。

研究人员接下来确认该方法能够回收来自不同突触下位置的蛋白质。使用SynGO数据库将突触下位置分配到数据集中，发现其在许多突触前和突触后位置均富集。事实上，突触前和突触后蛋白同样富集。免疫印迹证实了突触前蛋白在制备物中的存在。因此，该方法提供了对突触蛋白质组的广泛视角。

仅在一个样本中鉴定出少量蛋白质。这些蛋白质可能非常有趣，因为它们可能是特定突触类型的标记物。然而，大多数这些蛋白质仅在三个重复中的一个中鉴定，且丰度非常低。因此，研究人员决定在后续分析中排除这些分子。数据表明，三突触环中很少有蛋白质是某个突触类型独有的，功能不同的突触在其组成水平上几乎相同。

差异表达突触蛋白的鉴定和验证

上述数据暗示定量而非定性变异驱动了突触间的功能多样性。为了鉴定差异表达突触蛋白，研究人员使用一种设计用于分析无标记质谱获得的肽段丰度的岭回归方法。共鉴定出283个显著过表达蛋白，占整个数据集的14%，分别在CA3-CA1、DG-CA3和EC-DG突触中鉴定出78、157和48个。

为了验证蛋白质组学结果，研究人员首先对六个差异表达蛋白在手动解剖海马区获得的突触部分中进行免疫印迹分析，发现蛋白质组学和免疫印迹数据完全一致。随后，在海马切片上对另外六个差异表达蛋白和突触前或突触后标记进行双重免疫荧光，特异性观察它们的突触丰度。对于每个双重免疫荧光，在CA1辐射层、CA3透明层和齿状回分子层中量化重叠信号的强度。这总是在蛋白质组学鉴定出最大丰度的突触中最高，证实了初步发现。

研究人员还进行了蛋白质组学数据的电生理验证。基于GluA2在CA3-CA1突触中更丰富，且含有GluA2的AMPAR具有较慢的失活动力学，研究人员研究了CA1锥体神经元中的微型兴奋性突触后电流衰减是否比CA3锥体神经元慢。CA1和CA3神经元的mEPSCs振幅相似，但CA1神经元呈现显著更慢的衰减，加权平均时间常数在CA1神经元为6.82毫秒，CA3神经元为2.48毫秒。这种不同的动力学与蛋白质组数据表明的CA3-CA1突触中GluA2-containing AMPARs数量增加一致。

基因表达对突触蛋白质组多样性的贡献

在鉴定和验证了跨突触类型的差异表达蛋白后，研究人员询问基因表达机制是否可以解释这种变异性的某些部分。为了实现这一目标，他们分析了来自Allen小鼠脑图谱的原位杂交研究和来自背侧CA1、背侧CA3、齿状回和内嗅皮层的兴奋性神经元的单细胞RNA测序数据，并将它们与蛋白质组丰度进行比较。

当上调蛋白在其形成的突触前和/或突触后神经元中显示最高RNA表达时，认为蛋白质和RNA数据一致。观察到与原位杂交和单细胞RNA测序数据的蛋白质与RNA丰度一致性分别为35%和34%。重要的是，置换检验表明这种一致性百分比显著高于偶然预期。

为了研究在一个突触类型中表达最高的蛋白质相关的生物学功能，研究人员使用pathfindR工具对信号通路和GO术语进行了富集分析。pathfindR构建蛋白质-蛋白质相互作用网络并将富集术语映射到其上。使用层次聚类和成对kappa统计，pathfindR为每个网络识别一个"代表性"术语。

研究人员首先澄清是否少数蛋白质负责大部分富集术语，这是通路富集分析中常见的偏差。然而情况并非如此，因为每个蛋白质的富集术语比率很低，且所有样本中贡献术语的蛋白质比例很高。重要的是，大多数富集通路和GO术语仅在一个突触类型中发现，因此有效地告知了它们独特的功能特性。所有样本中仅5个术语富集。这些与突触功能密切相关，包括化学突触传递、突触后信号传导、肌动蛋白细胞骨架和细胞粘附。

虽然CA3-CA1和DG-CA3突触共享几个功能类别，但仅在DG-CA3和EC-DG突触之间发现3个，CA3-CA1和EC-DG突触之间没有。值得注意的是，GO术语"Schaffer collateral CA1 synapse"在CA3-CA1和DG-CA3突触的差异表达蛋白中富集。这些突触共享的通路中，研究人员鉴定了众所周知的突触过程，如通过钙的信号传导、通过Ras和Rho GTPases或通过BDNF、Ephrins和Semaphorins的跨突触信号传导。

CA3-CA1突触中AMPAR运输、肌动蛋白动力学和能量代谢的调控

如前所述，研究人员观察到这些突触中GluA2 AMPAR亚基丰度增加，表明它们会有更多含Gria2的AMPARs，这一观察得到mEPSCs记录的支持。与这些发现一致，富集通路分析检索到"含GluA2的AMPAR运输"在这些突触的差异表达蛋白中强烈过度表征。其他参与AMPAR运输调控的蛋白质，如控制网格蛋白介导的内吞作用和神经元pentraxin 1的蛋白质，也在这些突触中强烈富集。

虽然肌动蛋白相关类别在所有突触类型中发现，但CA3-CA1突触呈现更多与微丝相关的功能类别，特别是其聚合。例如，Arp2/3复合物的所有7个成员，为肌动蛋白分支和树突棘结构可塑性所必需，在此突触类型中呈现更高丰度，尽管只有三个达到统计学显著性。这表明这些突触中棘结构动力学的控制更精细。

研究人员还发现非经典Wnt信号通路在CA3-CA1突触中过度表征。该通路控制钙水平和突触可塑性。其中钙调磷酸酶和钙激活蛋白激酶C在此突触类型中过表达，表明通过Wnt信号传导调节棘钙动力学在这些突触中可能特别相关。

最后，多个与能量生产相关的功能类别在CA3-CA1突触中特异性过度表征。表明这些突触会有更高的能量需求。这些包括调节葡萄糖转运蛋白到质膜运输的蛋白质、10个糖酵解酶中的5个以及与丙酮酸代谢或ATP合成相关的酶。

DG-CA3突触中对代谢型信号传导、翻译和神经丝的控制

突触后代谢型谷氨酸受体Grm1在DG-CA3突触中呈现丰度增加，特别是相对于CA3-CA1突触，有3.4倍增加。Grm1通过Gq蛋白α亚基信号传导，调节第二信使肌醇三磷酸和甘油二酯水平。信号通路"G alpha Q信号事件"和"DAG和IP3信号传导"也在DG-CA3突触中显著富集。类似地，已知调节代谢型谷氨酸信号传导的Necab2和Homer3在DG-CA3突触中发现强烈过表达。

DG-CA3突触中的差异表达蛋白也调节NMDA和AMPA受体。研究人员发现与NMDAR功能相关的通路过度表征，包括"NMDAR活性调控"或"NMDAR介导的神经元传递的负调控"。在控制NMDARs的差异表达蛋白中，PTK2B可能特别相关，因为这种激酶也与Grm1相互作用。研究人员还鉴定了调节AMPAR功能的蛋白质，包括Shisa6、Syt17、Snap47和Nptxr。与AMPA和NMDA受体功能都相关的是通过ERK1/2激酶的信号传导。GO通路"ERK1和ERK2级联的正调控"也在DG-CA3突触中发现过度表征。

有趣的是，在NMDAR相关蛋白中，研究人员鉴定了神经丝轻链，已知参与其运输。实际上，形成神经丝的四种蛋白质在DG-CA3突触中显著过表达。许多Rho家族小GTPases的调节剂，包括GTP酶激活蛋白和特别是鸟嘌呤核苷酸交换因子，也发现过表达。这表明这些信号分子调控的通路，主要与细胞骨架调控相关，可能在此突触类型中以更特异的方式控制。

最后，研究人员观察到DG-CA3突触中几乎所有核糖体蛋白的显著增加，其中21个达到统计学显著性。几个与蛋白质稳态相关的功能类别在此突触类型中过度表征，包括"蛋白质稳定性"或"未折叠蛋白质结合"，以及参与信使RNA运输到树突的Pura和Purg。与这些发现一致，研究人员回顾单细胞RNA测序分析，也发现齿状回中大多数核糖体基因的非常强烈上调。这些发现，加上最近发现局部翻译发生在苔藓纤维膨体，表明蛋白质稳态在此突触类型中可能发挥特别相关的作用。

EC-DG突触中独特的细胞外基质

EC-DG突触的蛋白质组呈现几种差异表达蛋白聚糖，包括Bcan、Ncan、Agrn和Hspg2。所有这些蛋白质的突触位置有充分记录，主要定位到细胞外基质。实际上，GO术语"细胞外基质结构组成"和与细胞外基质相关的Reactome通路"整合素细胞表面相互作用"在EC-DG突触中过度表征。因此研究人员观察到细胞外基质的差异组成，特别是关于蛋白聚糖的丰度，可以特异性调节此突触类型的特性。如前，研究人员还鉴定了与AMPAR调控相关的过表达蛋白。这些包括"受体型酪氨酸蛋白磷酸酶δ"、AMPAR辅助蛋白Shisa9，以及支架蛋白Epb41l1，已知与AMPAR的A1亚基结合，调节其活动依赖性插入质膜。

最后，在EC-DG突触中表达最高的蛋白质还检索到几个与支链氨基酸分解代谢相关的通路，包括"缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解"、"支链氨基酸分解代谢"或"α氨基酸代谢过程"。合成谷氨酸的两个代谢通路之一需要这些氨基酸的分解代谢，此反应的产物进入TCA循环。EC-DG突触可能优先使用此谷氨酸合成通路，将突触传递与能量生产耦合。

谷氨酸受体相关基因的不同神经元表达

不同神经元形成的突触呈现谷氨酸受体调控蛋白的不同表达模式，促使研究人员研究这是否由遗传因素介导。而且，如上所示，基因表达将解释突触间发现的部分蛋白质组变异。因此，研究人员回到ABCA数据库，探索海马体和下托兴奋性神经元中的基因表达。在这些区域，ABCA定义了55种兴奋性神经元类型，分为8类。研究人员首先将所有基因分为两组，编码参考蛋白质组的基因，称为"突触基因"，和其余基因。发现18%的突触基因呈现神经元类别间的表达差异，17%呈现神经元类型间的表达差异。有趣的是，差异表达基因的频率在突触基因中高3倍。与从所有基因或非突触基因中随机抽取相同大小的基因集相比，这仍然显著。

上调突触基因主要存在于一个神经元类别中，偶尔两个，而下调基因出现更频繁，最多5个类别。在神经元类型比较中也发生相同情况，下调基因出现更频繁。由于目标是捕捉每个神经元类别/类型最独特的功能类别，研究人员仅考虑上调基因进行后续分析。

接下来，研究人员希望比较上调突触基因的表达模式 between neuronal types。为了实现这一目标，他们计算了每对神经元这些基因的表达相关系数并执行层次聚类。来自相同类别的神经元分组在一起，完美复制了ABCA用整个转录组获得的分类。这表明密切相关的神经元中的突触基因具有更相似的表达模式，并且突触