中国西部F基因型牛肠道病毒的分离与鉴定

《Microbiology Spectrum》：Isolation and identification of a genotype F bovine enterovirus in western China

本研究从四川、青海、内蒙古的犊牛腹泻粪便样本中分离到新型牛肠病毒Sichuan/SQ/20，属BEV-F1型。体外实验显示其在MDBK细胞中3小时启动复制，48小时达峰（1×10^8.73 TCID50/0.1mL），对55℃热处理敏感；体内实验表明病毒主要定植于脾脏，引发特征性病变，但无严重组织损伤。该研究为疫苗开发及防控策略提供基础。

　　
近年来，牛肠道病毒（Bovine Enterovirus, BEV）的流行病学特征和分子生物学特性受到广泛关注。该病毒属于小RNA病毒科（Picornaviridae）的肠道病毒属（Enterovirus genus），其基因组由单链正链RNA构成，具有遗传高度可塑性。研究表明，BEV-F1亚型在亚洲多国牛群中呈现持续流行态势，但病毒致病机制尚不明确。2024年，中国科研团队通过系统性的病毒分离和生物学特性分析，首次从四川省、青海省和内蒙古自治区分离出BEV-F1亚型的新型毒株Sichuan/SQ/20（GenBank: PV290163.1），为后续防控研究提供了重要参考。

在样本采集阶段，研究团队针对犊牛腹泻高发期（6-10月）采集了108份粪便样本。通过特异性RT-PCR检测发现，6份样本携带BEV病毒核酸。值得注意的是，该病毒在体外细胞培养中表现出显著的细胞特异性，仅能在牛肾细胞（MDBK）中高效复制并产生典型细胞病变效应（CPE），而对恒河猴肾细胞（Vero）和仓鼠肾细胞（BHK-21）的感染效率显著降低。这种细胞宿主偏好性可能与病毒受体分布或细胞因子环境差异有关，但具体机制仍需深入探究。

病毒纯化过程中采用了三重 plaque purification技术，结合电子显微镜观察（图1D）证实该病毒颗粒为直径30-40nm的非包膜小球状粒子，与已描述的BEV形态特征一致。病毒滴定实验显示其最大感染滴度为10^8.73 TCID50/0.1mL，且在55℃下经12分钟热处理即可完全灭活。这种热敏感性特征对冷链运输和医疗废物处理具有重要指导意义。

分子生物学分析方面，通过四对特异性引物构建了覆盖病毒全基因组的测序体系。系统发育树（图3）显示，Sichuan/SQ/20与2011年在中国分离的HeN-YR91毒株及日本2014年发现的JPN-TottoriU31毒株具有高度同源性（VP1区序列相似度达83.9%），共同构成BEV-F1亚型的主要进化分支。特别值得注意的是，该毒株在P1区氨基酸序列中形成了独特的抗原表位（图4），这可能解释其在实验动物模型中表现出的低致病性特征。

动物致病性实验（图5）揭示了关键生物学特性：1）病毒主要感染脾脏，造成红髓萎缩和淋巴细胞增生（HE染色显示 sinusoidal dilation 和 white pulp expansion）；2）肝脏作为次级感染器官，病毒载量达到峰值后迅速清除；3）肠道组织未检测到显著病理变化。这种组织特异性感染模式提示BEV可能通过脾脏微环境介导免疫逃逸，但具体分子机制尚待阐明。

温度敏感性实验（图2B-C）发现该毒株在42-50℃范围内保持稳定，而在55℃暴露12分钟即完全灭活。这种温度耐受特性与病毒衣壳蛋白的热稳定性密切相关，但与其他同属病毒（如脊髓灰质炎病毒）相比，BEV表现出更强的环境适应性。这可能与其在牛群中持续低水平传播的生态位有关。

研究还建立了小鼠感染模型，通过荧光原位杂交（IFA）技术观察到病毒在肝、脾、肠等组织中的特异性表达（图5D）。值得注意的是，尽管病毒在脾脏中持续存在至第7天，但未观察到小鼠出现临床症状。这种宿主免疫应答与病毒复制动力学之间的平衡，可能为设计亚单位疫苗提供了理论依据——通过靶向脾脏特异性抗原表位，可能诱导更强的黏膜免疫应答。

在流行病学层面，该研究揭示了BEV-F1亚型在中国的地理分布特征。测序数据显示，该毒株与德国2014年分离的BEV-F1毒株（DQ092770）在P1区仅存在72.7%的核苷酸相似性，表明该病毒可能通过持续基因重组或水平传播机制在区域内进化。此外，热灭活实验中55℃处理12分钟的有效性，为现场应急处理提供了技术参数。

研究团队通过构建多维度分析体系，首次系统揭示了BEV-F1亚型在体外培养（ MDBK细胞）、体内感染（BALB/c小鼠）和分子进化（系统发育树）三个层面的关键特征。特别是发现了病毒在脾脏的持续复制模式，这与该器官作为免疫核心的地位相吻合。这种病毒-宿主互作机制的研究，对开发靶向脾脏的免疫干预策略具有重要参考价值。

该成果不仅完善了BEV分类体系（GenBank新增PV290163序列），更在防控层面提出三项关键建议：1）基于脾脏病理特征，需研发特异性器官靶向诊断试剂；2）利用55℃热灭活特性，优化粪便样本运输的应急处理流程；3）针对VP1区高相似性但氨基酸序列存在差异的抗原表位，建议开发多价重组疫苗。这些发现为应对未来可能出现的BEV变异株提供了理论支撑和技术储备。

当前研究仍存在一定局限性，主要体现在实验动物模型的选择上。虽然小鼠模型成功揭示了病毒在脾脏的偏好性感染，但牛、羊等天然宿主的免疫应答机制仍需进一步验证。此外，病毒在环境中的半衰期、跨物种传播风险等关键问题仍有待深入研究。未来可结合单细胞测序技术和宏基因组学，更全面解析病毒在宿主内的分布规律及免疫逃逸机制。