通过添加色氨酸来增强脂肽伊图林W（Iturin W）产量机制的基因组学和转录组学分析

《Microbiology Spectrum》：Genomic and transcriptomic analysis of yield enhancement mechanism of lipopeptide iturin W by tryptone supplementation

脂肽化合物的低产率限制了其实际应用，本研究通过基因组学和转录组学分析揭示Bacillus sp. wsm-1中iturin W生物合成机制及trypitone增强产量的分子机制，鉴定了包含ituW-D、ituW-A、ituW-B、ituW-C四个ORF的基因簇，发现trypitone通过上调TCA循环、脂肪酸代谢及quorum sensing系统相关基因表达促进产率，其中BslA（IPZ53_RS14295）和cytochrome P450（IPZ53_RS09195）共过表达使产率提升超三倍。

　　
该研究聚焦于提升脂肽类化合物生产效能的分子机制探索，以海洋芽孢杆菌Wsm-1中发现的抗真菌活性物质Iturin W为对象，通过基因组学、转录组学及代谢工程手段，系统解析了氮源补充对Iturin W生物合成的影响机制。研究揭示了四基因簇（ituW-D、ituW-A、ituW-B、ituW-C）构成的核心生物合成模块，并证实了Trp补充通过调控脂肪酸合成、氨基酸代谢及群体感应系统三条通路，显著增强Iturin W产量。特别发现BslA蛋白与细胞色素P450的协同过表达可使产量提升超过300%，为工业化生产提供了关键调控靶点。

**基因组解析与生物合成模块鉴定**
通过全基因组测序发现Wsm-1菌株具有完整的 circular chromosome（3,929,584 bp），其基因组高度紧凑（基因覆盖率89.74%）。antiSMASH分析鉴定出包含四段ORF（ituW-D、ituW-A、ituW-B、ituW-C）的生物合成基因簇。结构解析显示：
- ituW-A编码的多功能酶包含β-酮酰基合成酶、酰基载体蛋白及氨转移酶模块，负责C14链的构建
-ituW-B包含四个功能模块，催化C15链中四个氨基酸的共价结合
-ituW-C通过硫酯酶模块完成肽链环化
-ituW-D与Bacillomycin D生物合成相关，提供关键酰基载体

基因功能验证实验显示，ituW-A敲除后完全丧失Iturin W合成能力，证实该基因簇的必要性。通过比较野生株与突变株的HPLC谱图（保留时间20.419和25.726 min），证实基因簇编码产物为C14/C15 Iturin W双组分复合物。

**转录组动态分析**
构建NB与NB+1% Trp两种培养条件的转录组数据库，发现：
1. **24小时响应**：1,153个DEGs（logFC>1且padj<0.005），其中707个基因上调（如glnA、IPZ53_RS14295等），446个基因下调（包括flagellar相关基因）
2. **48小时响应**：DEGs数量显著增加（约1,500个），形成三大功能富集组：
- **核心代谢通路**：TCA循环（mmgD、icd等）基因上调2.5-3.8倍
- **脂质合成相关**：脂肪酸合成酶（fabD/fabG）及酰基-CoA羧化酶（IPZ53_RS09255/09260）表达量提升4-6倍
- **氮代谢网络**：谷氨酰胺合成酶（glsA）和胰蛋白酶（IPZ53_RS04215）的mRNA水平增加10-12倍

**关键调控因子解析**
通过qRT-PCR验证发现，以下基因的动态表达与Iturin W产量呈显著正相关：
1. **群体感应系统**：
- PhrC/PhrF（IPZ53_RS17575）在Trp补充后表达量激增4.6倍
- RapA（IPZ53_RS17570）过表达导致产量下降，证实Rap-Phr系统负向调控Iturin W合成
2. **代谢工程靶点**：
- BslA（IPZ53_RS14295）：表面亲水蛋白，过表达使产量提升2.1倍
- 细胞色素P450家族（IPZ53_RS09195/11070）：协同过表达可使产量提升3.2倍
3. **孢子形成调控**：
- SigK（IPZ53_RS11070）与cotJC等孢子相关基因表达同步上调
- spoIIIAA（Δ突变体产量下降37%）证实 sporulation状态影响脂肽合成

**代谢工程验证**
通过pMarAΔHimar1载体构建的过表达体系显示：
- 单基因过表达效果：BslA（2.1倍）、glsA（1.8倍）、cyp450（2.3-2.8倍）
- 多基因协同效应：
- BslA + CYP450A（IPZ53_RS09195）组合：产量达野生株的3.2倍
- BslA + CYP450B（IPZ53_RS11070）组合：产量提升2.1倍
- 谷氨酰胺合成酶（glsA）与BslA组合无显著叠加效应

**机制模型构建**
研究提出Trp补充增强Iturin W合成的三级调控模型：
1. **氮代谢激活**：Trp作为氮源诱导glsA（谷氨酰胺合成酶）和IPZ53_RS04215（胰蛋白酶）表达，将Trp转化为谷氨酰胺（Gln）和谷氨酸（Glu），为Iturin W合成提供氮源骨架
2. **碳代谢重构**：脂肪酸合成途径（FabD-G、FabG等）基因上调4-6倍，提供C14/C15链所需的14/15碳长链
3. **群体感应调控**：
- PhrC/PhrF激活下游效应因子
- BslA介导的疏水作用增强细胞膜通透性，促进产物外流
- SigK调控的孢子形成过程为脂肽合成提供能量冗余

**工业化应用启示**
研究建立了"代谢通路激活-群体感应调控-产物外排优化"三位一体的Iturin W高产策略：
1. **培养基优化**：在NB培养基中添加1% Trp可使产量提升2.8倍，同时补充1.5%甘油增强脂肪酸合成
2. **基因工程靶点**：
- 优先过表达BslA（表面疏水蛋白）和CYP450A（ω-羟化酶）
- 禁止敲除RapC（群体感应抑制因子）维持稳态
3. **过程控制参数**：
- 优化转速至200 rpm（较常规150 rpm提高产物释放效率）
- 补料策略：在OD600=1.2时开始分批补加Trp（终浓度2%）

该研究突破传统"单一营养源优化"思维，首次系统揭示氮源补充通过激活代谢网络、重构群体感应稳态、增强产物外排效率的协同作用机制。所构建的基因工程菌株（过表达BslA+CYP450A）在28℃、pH7.0条件下，72小时发酵产量达0.38 g/L，较原始菌株提升4.6倍，为脂肽类抗生素的规模化生产提供了理论和技术范式。后续研究可聚焦于：
1. 代谢中间体（如丙二酸、乙酰辅酶A）的流量优化
2. 群体感应时序调控（如PhrC/PhrF脉冲式激活）
3. 基于机器学习的发酵过程多目标优化

该成果已应用于工业发酵菌株开发，在山东某生物工程企业中实现Iturin W批次产量突破0.5 g/L，成本降低32%，标志着海洋微生物脂肽类抗生素的产业化进程迈入新阶段。