在粪肠球菌（E. faecalis）中，SEDS糖基转移酶通过CroS/R双组分系统被上调，以增强细胞壁应激期间的肽聚糖合成

《mSphere》：SEDS glycosyltransferases in E. faecalis are upregulated by the CroS/R two-component system to enhance peptidoglycan synthesis during cell wall stress

肠球菌通过诱导FtsW2和RodA2的糖基转移酶活性增强细胞壁合成及头孢菌素耐药性，其表达受CroS/R信号系统调控。

　　
摘要
肠球菌（Enterococcus）作为人体肠道共生菌，其独特的细胞壁合成机制使其对多种抗生素具有天然耐药性。头孢菌素类抗生素通过抑制细胞壁肽聚糖（peptidoglycan）交联反应中的青霉素结合蛋白（PBP）发挥作用，而肠球菌的耐药机制与SEDS蛋白（shape, elongation, division, and sporulation）密切相关。SEDS蛋白是一类具有糖基转移酶（GTase）活性的跨膜酶，负责催化肽聚糖链的延长。大多数细菌仅编码两个SEDS蛋白（FtsW和RodA），分别与PBPs形成复合物完成细胞壁合成。然而，肠球菌的基因组中额外编码了两个SEDS同源蛋白（OG1RF_11070和OG1RF_11071），其功能长期未明。本研究通过结构分析、蛋白互作实验和功能验证，首次揭示了这两条基因的生物学意义，并阐明其在抗生素耐药性中的关键作用。

**引言**
肠球菌是一类重要的条件致病菌，可引发菌血症、心内膜炎等严重感染。其耐药机制复杂，尤其对头孢菌素类抗生素的耐药性成为临床治疗难题。既往研究表明，FtsW蛋白通过激活PBPs（如PbpB）的GTase活性，参与肽聚糖链的延长和交联，是头孢菌素耐药的核心靶点。然而，肠球菌基因组中存在的额外SEDS蛋白尚未被充分解析。本研究以肠球菌（Enterococcus faecalis OG1RF）为模型，系统探究OG1RF_11070（FtsW2）和OG1RF_11071（RodA2）的功能及调控机制。

**实验结果**
1. **FtsW2和RodA2的分子特征**
序列比对显示，FtsW2与FtsW高度相似（同源性＞80%），而RodA2与RodA同源性较高（＞75%）。进化树分析表明，FtsW2和RodA2分别与FtsW和RodA形成独立进化分支，说明其并非基因重复产物，而是古老基因的保留形式。值得注意的是，这两条基因在肠球菌基因组中呈相邻排列，但进化上彼此独立。

2. **蛋白互作与酶活性验证**
实验发现，FtsW2优先与PbpB结合，而RodA2与PbpA的亲和力更高。体外酶活性检测证实，FtsW2和RodA2均具有GTase活性，能催化脂肽（lipid II）聚合为多聚体。其中，FtsW2的活性不受PBP调控，而RodA2的活性可被PbpA modestly增强。突变实验进一步证明，RodA2的关键催化残基（D281）对酶活性至关重要。

3. **动态表达调控机制**
RT-qPCR分析显示，当FtsW因头孢菌素压力被耗竭时，FtsW2和RodA2的转录量显著上调（约4倍），且这种调控依赖于croS/R信号通路。实验通过构建croR缺陷菌株，证实该系统的激活是FtsW2和RodA2表达升高的必要条件。此外，联合删除FtsW2和RodA2会加剧FtsW耗竭导致的生长缺陷和头孢菌素敏感性升高，表明二者协同补偿FtsW功能。

4. **耐药性增强的分子机制**
通过质谱分析和表面等离子共振（SPR）技术，确认FtsW2和RodA2可分别替代FtsW和RodA参与细胞壁合成。在FtsW耗竭的菌株中，过表达FtsW2或RodA2可使头孢菌素最小抑菌浓度（MIC）从0.25 μg/mL恢复至4 μg/mL，而RodA的耗竭同样降低MIC值（从64 μg/mL降至8 μg/mL）。这些数据揭示了FtsW2和RodA2作为“冗余系统”在耐药性维持中的关键作用。

**讨论**
1. **SEDS蛋白的多态性进化**
肠球菌编码的四个SEDS蛋白（FtsW、RodA、FtsW2、RodA2）构成多酶系统，提示其可能通过分工协作适应复杂环境压力。比较基因组学显示，FtsW2和RodA2在肠球菌属中广泛分布，但仅在部分近缘菌（如肠球菌和肠球菌）中编码完整同源蛋白，暗示其功能在进化中可能因生态位差异而分化。

2. **耐药性调控的新维度**
CroS/R系统作为细胞壁应力响应的核心调控器，不仅激活自身基因表达，还通过诱导FtsW2和RodA2的上调，动态平衡细胞壁合成与破坏。这种“压力响应冗余”机制可解释肠球菌在多重压力下（如抗生素暴露）的适应性进化。

3. **药物靶点开发潜力**
实验首次证实RodA是肠球菌头孢菌素耐药的新靶点。联合抑制FtsW2/RodA2与FtsW/RodA，可能打破细菌的冗余备份系统，增强抗生素疗效。此外，FtsW2的独立活性提示其可能作为广谱抗性的关键靶点。

4. **进化与功能关联性**
蛋白质组学分析显示，FtsW2与FtsW的催化结构域高度保守，但C末端存在独特修饰域，可能参与与PbpB的特异性结合。RodA2的序列特征更接近RodA，其与PbpA的互作可能通过激活GTase活性增强交联效率。这些结构差异可能解释其在压力响应中的功能分化。

**未来研究方向**
1. **环境压力下的功能激活**
探索FtsW2/RodA2在非抗生素压力（如氧化应激、渗透压变化）下的激活机制，明确其功能边界。

2. **药物敏感性监测**
建立肠球菌SEDS蛋白谱系数据库，评估FtsW2/RodA2在临床分离株中的表达水平及其对新型抗生素的敏感性。

3. **三维结构解析**
通过冷冻电镜和X射线晶体学解析FtsW2/RodA2与PBP复合物的三维结构，为药物设计提供靶点信息。

本研究通过多组学整合（基因组、转录组、蛋白质组）和动态功能验证，首次系统揭示了肠球菌SEDS蛋白冗余系统的运作机制，为开发靶向多重耐药菌的新型疗法提供了理论依据。