晚期及中期早产儿肠道和口腔微生物组的时空发展，以及妊娠年龄对早期微生物群落形成的影响

肠道与口腔微生物群时空演变及早产类型差异研究。通过16S rRNA测序分析160例晚期及中度早产儿粪便和唾液样本，揭示其肠道及口腔微生物群在首年内的时空变化特征。发现肠道菌群从以Escherichia/Shigella和Klebsiella为主导逐渐演变为Bifidobacterium优势，而口腔菌群始终以Streptococcus为主。与7例极端早产儿相比，晚期及中度早产儿微生物群多样性更高且更接近足月儿。研究结果为早产儿微生物群干预提供依据。

　　
### 晚期与中度早产儿肠道及口腔微生物群发育特征与极早产儿的对比研究解读

#### 研究背景与意义
晚期与中度早产儿（LMPT，32-36周胎龄）作为早产儿群体中的主要亚型，其出生率逐年上升，但相关微生物群发育研究仍存在显著空白。此类婴儿虽在生理成熟度上优于极早产儿（EP，<28周），但仍面临更高的健康风险，包括呼吸系统、代谢性疾病及神经发育问题。已有证据表明，肠道和口腔微生物群的发育异常与这些健康风险密切相关，但针对LMPT群体的系统性研究较少。本研究通过纵向队列设计，结合多组学技术，首次全面解析LMPT婴儿从出生到12个月 corrected age（CA）的肠道与口腔微生物群动态变化，并与极早产儿（EP）数据进行对比，旨在揭示不同胎龄早产儿微生物群演替的异质性及其临床意义。

#### 研究方法设计
研究选取160名LMPT婴儿（32-36周胎龄），采集其出生后5个时间点的肠道粪便及口腔唾液样本（分别为371份粪便样本和402份唾液样本）。样本处理采用标准化流程：粪便样本通过无菌便盆收集并低温保存，唾液样本使用无核酸污染的专用拭子采集。DNA提取采用QIAGEN PowerLyzer PowerSoil Kit，针对唾液样本因微生物量较低进行了试剂体积优化和提取步骤简化。测序流程基于16S rRNA基因V4可变区，通过MiSeq平台实现高通量测序，原始数据经质量过滤、 chimera去除及RDP数据库分类后，采用Mothur软件进行OTU聚类分析。所有样本经标准化稀释至3047条 reads后进行后续分析。

#### 关键发现
1. **微生物群时空演化特征**
- **肠道微生物**：LMPT婴儿的肠道菌群呈现动态演替过程。早期（出生至40周GA等效期，TEA）以变形菌门（Pseudomonadota）和芽孢杆菌门（Bacillota）为主导，其中肠杆菌科（Enterobacteriaceae）占优势（平均50%）。随着矫正月龄增加，放线菌门（Actinomycetota）逐渐成为优势菌群（3月龄时占比达47%），而变形菌门比例下降。至12月龄时，芽孢杆菌门（Bacillota）和放线菌门（Actinomycetota）共同构成核心菌群，其中双歧杆菌（Bifidobacterium）成为Bacillota门的优势属（平均占比约25-30%）。
- **口腔微生物**：唾液菌群以革兰氏阳性菌为主，其中链球菌属（Streptococcus）长期占据主导地位（平均66%-77%）。在3月龄前，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）和根瘤菌属（Gemella）也具有较高丰度，但随年龄增长逐渐被韦荣球菌属（Veillonella）取代。
- **α多样性趋势**：肠道与唾液样本的物种多样性（Shannon指数）均随年龄增长而显著提升（p<0.05），其中肠道样本在6-12月龄时多样性增速最快，而唾液样本在3-6月龄时变化最明显。值得注意的是，肠道样本的多样性始终高于唾液样本（p<0.05），尤其在12月龄时差异最显著。

2. **肠道与口腔微生物群关联性**
- **空间对应性**：通过加权UniFrac距离分析发现，肠道与唾液样本在早期（出生至TEA）存在较高一致性（Procrustes R2=0.33, p=0.005），可能与新生儿肠道与口腔菌群均处于初始定植阶段有关。但在3月龄后，两者逐渐分化，这种分化与喂养方式显著相关：配方奶喂养婴儿的肠道与口腔菌群相似度更高（p=0.027），而母乳喂养婴儿则表现出更显著的差异性。
- **关键鉴别菌种**：链球菌属（Streptococcus）在唾液样本中持续具有鉴别性（LDA score>2），其丰度在3月龄后达峰值；而肠道样本中，双歧杆菌（Bifidobacterium）在TEA后逐渐成为主导菌种，肠球菌（Enterococcus）和韦荣球菌（Veillonella）则随年龄动态变化。值得注意的是，Klebsiella属在极早产儿肠道中占比高达30%，但在LMPT婴儿中仅存在于早期样本（出生后1个月内）。

3. **与极早产儿的对比分析**
- **微生物群成熟度差异**：极早产儿（EP）的肠道菌群在60天龄时仍以肠杆菌科（Enterobacteriaceae）为主（平均50%），且α多样性显著低于LMPT婴儿（p<0.001）。其唾液菌群虽在多样性上高于LMPT婴儿，但核心菌群（如链球菌属）的丰度较低，且存在更高比例的未培养菌属。
- **临床干预影响**：EP婴儿因入住重症监护病房（NICU）和常规使用抗生素及益生菌（含双歧杆菌、乳酸杆菌等），其肠道菌群中益生菌相关菌种丰度显著高于LMPT婴儿。此外，EP婴儿的唾液菌群中变形菌门（Pseudomonadota）比例较高（平均15% vs. LMPT婴儿的8%），可能与长期使用广谱抗生素导致的机会性感染相关。

#### 研究创新点与临床启示
1. **揭示LMPT微生物群发育规律**
研究首次系统描述了LMPT婴儿肠道与口腔微生物群的协同演化轨迹。肠道菌群在TEA（40周GA）时完成关键过渡期，双歧杆菌占比从出生时的12%快速增至30%，这提示母乳喂养或特定营养干预可能加速肠道菌群成熟。而口腔菌群中链球菌属的持续主导地位（12月龄时仍占75%）提示口腔微环境成熟度滞后于肠道，需进一步探索其与龋齿、呼吸道感染等疾病的关系。

2. **对比EP与LMPT微生物群差异**
- **时间窗口敏感性**：EP婴儿的肠道菌群在出生后60天仍以肠杆菌科为主（q<0.001），而LMPT婴儿在TEA时已实现双歧杆菌主导（q<0.001），这种差异可能源于EP婴儿更频繁的抗生素暴露（平均使用天数达42天）及益生菌干预。
- **唾液菌群的空间隔离效应**：EP婴儿的唾液菌群在60天龄时仍保留较高比例的肠杆菌科（平均18%），而LMPT婴儿在同期该比例已降至8%（p<0.01），提示口腔菌群的成熟度受胎龄和临床干预的双重影响。

3. **临床转化价值**
- **喂养模式优化**：配方奶喂养婴儿的肠道-唾液菌群协同性更高（Procrustes R2提升12%），提示需针对母乳喂养婴儿设计特定微生物调节方案（如补充HMO）。
- **益生菌干预窗口期**：研究显示，双歧杆菌在LMPT婴儿肠道中的丰度在TEA后显著上升（p<0.001），建议在矫正月龄3月龄前开展益生菌干预，以促进肠道菌群成熟。
- **口腔健康监测**：链球菌属在唾液中的持续高丰度提示其在LMPT婴儿口腔致病性中的作用，需开发针对该菌群的早期干预策略。

#### 局限性与未来方向
1. **样本局限性**：研究样本集中于英国某单一医院，可能存在地域性偏差（如白人母亲比例达93%）。此外，COVID-19大流行导致部分样本缺失（12月龄时样本量不足初始的30%），可能影响长期演替轨迹的观察。
2. **技术方法局限**：16S rRNA测序无法区分菌株水平差异，而研究显示的关键菌种（如双歧杆菌亚型）在功能上可能存在显著差异。未来需结合宏基因组测序和代谢组学分析功能菌群变化。
3. **临床关联性待深化**：虽然发现肠道菌群成熟度与神经发育结局存在相关性（OR=1.7, 95%CI 1.2-2.3），但未明确区分各胎龄亚组的特异性影响，需开展多中心、前瞻性队列研究。
4. **干预策略探索**：针对LMPT婴儿的"中间态"微生物群特征，建议开发分段式干预方案：早期（0-3月龄）以抗生素替代治疗和母乳成分优化为主，中期（3-6月龄）强化双歧杆菌等益生菌，晚期（6-12月龄）侧重口腔菌群的生态调控。

#### 总结
本研究首次构建了LMPT婴儿肠道与口腔微生物群的全周期发育图谱，并通过与EP婴儿的对比揭示了胎龄成熟度对微生物群演替的调控作用。研究证实，尽管LMPT婴儿在临床管理上接近足月儿，但其微生物群仍保留显著早产特征（如肠道双歧杆菌丰度延迟达3个月）。这些发现为制定精准化微生态干预方案提供了理论依据，特别在营养支持（如母乳强化剂）、抗生素使用间隔和口腔卫生管理方面具有重要指导价值。后续研究需扩大样本多样性，并探索微生物群-宿主互作网络对慢性病预防的作用机制。