子囊菌门Pseudopithomyces属（Didymosphaeriacee科）成员的基因组草图

《Microbiology Resource Announcements》：Draft genome of a member of ascomycotal fungal genus Pseudopithomyces (family Didymosphaeriaceae)

从新加坡啤酒废水中分离出一株子囊菌门真菌，完成基因组测序及分类学鉴定。该 draft 基因组含43条contig，总长39.65 Mbp，BUSCO完整度98.9%。通过ITS序列、线粒体基因组及k-mer分析确认属于Pseudopithomyces新物种， designated为Pseudopithomyces sp. SBW1。

　　

摘要

我们报告了一种属于子囊菌属Pseudopithomyces的物种的基因组草图（分离株名称为SBW1），该基因组是通过从啤酒厂废水中培养得到的。这个由43个连续片段组成的基因组长度为39.65 Mbp，使用Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO)工具评估的完整性为98.9%。分类学鉴定得到了内部转录间隔区(ITS)序列、线粒体DNA序列以及k-mer分析的支持。

公告

Pseudopithomyces（1）是一个已知会感染人类和动物的真菌属（2–4）。Pseudopithomyces chartarum的一个基因组草图（3）已经公开（GenBank编号：GCA_033220655.1）；有关该属的最新基因组数据也可参考（5）。我们报告了从新加坡啤酒厂废水中分离出的一种Pseudopithomyces物种的基因组。该基因组的早期版本（6）是基于长读长数据构建的，被鉴定为Pseudopithomyces maydicus菌株SBW1（GenBank编号：GCA_026873275.1）。

我们通过在30°C下于固体酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖琼脂培养基上培养2天获得了该菌株。基因组DNA通过液氮处理和机械研磨后，使用Qiagen DNeasy PowerSoil Pro试剂盒提取。初步的分类鉴定是通过Sanger测序28S SSU-rRNA基因的D1/D2区域来进行的，使用的引物对为NL1和NL4，然后通过NCBI BLASTN网站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）与nr/nt数据库进行比对，结果显示与P. maydicus（序列号：MF919633）的相似度为99%，查询覆盖率为66%。

测序文库使用SQK-LSK109 Ligation Sequencing试剂盒（Oxford Nanopore Technologies, ONT）制备，并通过EXP-NDB104 Native Barcoding试剂盒进行条形码标记，随后在GridION（ONT；版本：2021/05/21）上测序72小时。还构建了一个Illumina TruSeq Nano文库，并在Illumina MiSeq设备上进行测序（双端测序，片段长度为301 bp）。

总共获得了1.53 Gbp的碱基调用和过滤后的GridION测序数据（https://github.com/rrwick/Porechop，平均长度：6,717 bp）以及3.28 Gbp的双端Illumina测序数据（n = 5,455,152），并使用hybridSPAdes软件（版本3.15.5-Linux；参数设置：--isolate, --nanopore, -t 30 and -k 21,33,55,77,99,127）进行组装（8）。从418个连续片段中（详见https://zenodo.org/records/15668185中的附加文件1），我们恢复了由43个连续片段组成的基因组草图（图1；更多细节见图例；详见https://zenodo.org/records/15668185中的附加文件2），其GC含量为49.9%，中位数k-mer覆盖率为27，总长度为39,656,604 bp（N50：1.76 Mbp），BUSCO工具评估的完整性为98.9%（BUSCO：C:98.9% [S:98.9%, D:0.0%, F:0.5%, M:0.6%, n:758；基于fungal_odb10谱系数据集进行测试；BUSCO版本：5.4.7）。

图1

图1 显示了整个组装中所有连续片段的基因组草图：A图表示k-mer覆盖率（log10）与连续片段GC比例的关系；B图表示k-mer覆盖率（log10）与连续片段长度（log10）的关系。蓝色数据点代表基因组草图中的连续片段。选中的连续片段包括含有rRNA操作子的片段23和42（其中片段42还包含完整的ITS区域）；片段40被标注为线粒体基因组。灰色数据点表示未被纳入基因组草图的连续片段，这些片段要么太短（<1000 bp），要么GC含量低于0.37（这是长连续片段组的GC含量上限）。那些丰度非常低的短连续片段可能来自kitome或其他污染源；而丰度较高的短片段（<1 kbp）可能是来自染色体、线粒体或非染色体序列的错误组装片段。

使用ITSx（10）鉴定出两个完整的ITS区域，一个来自主要连续片段集合（片段23；图1），另一个（片段42；图1）的覆盖率非常高（C_k = 3,230），提示其rRNA拷贝数可能很高（3,230/27 ≈120，11）。ITS序列（详见https://zenodo.org/records/15668185中的附加文件3）通过NCBI BLASTN与NCBI rRNA/ITS数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/177353）进行比对。第一个ITS区域被鉴定为Paraphaeosphaeria和Pseudopithomyces属，但查询覆盖率（qcovs）仅为61%，相似度（PID）为72–73%，表明重建质量较差。第二个ITS区域（详见https://zenodo.org/records/15668185中的附加文件5）的前三个匹配结果属于Pseudopithomyces（qcovs：87–100%；PID：96–97%），而第四和第五个匹配结果分别属于Paraconiothyrium brasiliense和Paracamarosporium hawaiiense，但特异性较低（qcovs：84–88%；PID：94–95%）。

第三个丰度较高的连续片段（片段40；长度37,881 bp，C_k = 1,328；图1）被标注为P. chartarum的线粒体基因组（GenBank编号：NC_035636.1；qcovs：81%；PID：97%；详见https://zenodo.org/records/15668185中的附加文件6）。使用sourmash（12工具对18,883个NCBI真菌基因组进行全基因组分析后，P. chartarum（GenBank编号：GCA_033220655.1）被确定为最接近的匹配结果（详见https://zenodo.org/records/15668185中的附加文件7）。

总体而言，这些发现支持将该物种归类为Pseudopithomyces属，并命名为Pseudopithomyces sp. SBW1。

致谢

我们感谢新加坡基因组研究所综合基因组平台的同事们完成了DNA测序和碱基调用工作。本研究得到了新加坡国家研究基金会（NRF）和教育部在“卓越研究中心计划”以及NRF竞争性研究计划（NRF-CRP21-2018-0006）“从食品加工废水中回收和微生物合成高价值水产饲料添加剂”项目下的支持。同时，我们也感谢新加坡国立大学的Chang Ying对初稿进行了认真审阅。

Y.C.、S.W.和R.B.H.W.分别构思了这项工作的不同部分，作为更广泛合作研究计划的一部分。E.S.协调并管理了整个项目，并获取和分析了废水样本。S.H.、F.Q.Y.G.和Y.C.分离并培养了该微生物，进行了分类鉴定并提取了基因组DNA。I.B.进一步分析了基因组DNA并协调了测序工作。K.A.、M.A.S.H.和R.B.H.W.进行了数据分析。所有作者都参与了数据解释工作。本文由R.B.H.W.撰写，其他作者也提供了意见。