在阿根廷感染水稻的一种水稻坏死花叶病毒分离株的近乎完整的基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Near-complete genome sequences of a rice necrosis mosaic virus isolate infecting rice in Argentina

水稻坏死花叶病毒（RNMV）首次在阿根廷被确认，通过元基因组测序、RT-PCR和小RNA测序发现其基因组与亚洲参考株高度相似，系统发育分析支持独立物种分类。

　　

摘要

虽然水稻坏死花叶病毒（RNMV）目前仅在亚洲有报道，但我们通过病毒宏基因组学方法在阿根廷的一株水稻上发现了这种病毒。我们进一步通过RT-PCR和小RNA Illumina测序确认了这一结果，获得了近乎完整的基因组，并证实了确实存在RNMV感染。

公告

在全球范围内已知感染水稻的病毒中，只有水稻白叶病毒（属于Phenuiviridae科的Tenuivirus oryzalbae种）、水稻条纹坏死病毒（属于Benyviridae科的Benyvirus oryzae种）以及Mal de Rio Cuarto病毒（属于Spinareoviridae科的Fijivirus cuartoense种）在南美洲也有记录（1，2）。在这项研究中，我们对2018年在科连特斯省和圣菲省采集的12株表现出症状的水稻（Oryza sativa）样本使用了与病毒颗粒相关的核酸以及Illumina HiSeq（2×150核苷酸双端测序）技术（3–5）。通过Illumina测序产生了总计3,780,924条经过修剪的读段（每个样本的读段数量在34,418到580,084条之间），这些读段使用CAP3软件进行了从头组装（6），并通过BLASTn和BLASTx工具鉴定出病毒基因组片段。我们在两株出现坏死、叶片皱缩和穗部变形症状的植株中检测到了RSNV。从一株位于贝尔翁-德阿斯特拉达（Corrientes）的植株（样本编号Arg1）中，我们获得了87个基因组片段，最长可达1,946个核苷酸，这些片段与在日本鉴定的水稻坏死花叶病毒（RNMV；属于Potyviridae科的Bymovirus oryzae种，参考基因组分别为LC055681.1和LC060925.1）的核苷酸序列具有93.4%的相似度。根据Thermo Fisher Scientific公司的Trizol试剂盒提取总RNA后，使用特异性引物（RNMV-R1-F-5′和RNMV-R1-R-3′）进行RT-PCR检测，并对613 bp的扩增子进行了Sanger测序，从而确认了RNMV感染。同一份RNA样本还使用了NEB公司的Next Multiplex Small-RNA Library Prep Set试剂盒制备小RNA（sRNA）文库，并通过Illumina NovaSeq 6000 SP Reagent Kit（SE50）进行了测序。在18nt–28nt大小的sRNA片段中，我们获得了25,326,985条经过修剪的读段，其中110,304条（占0.44%）通过Geneious v.9.1软件（Biomatters）与RNMV参考基因组进行了比对。使用Bowtie1.3.1和Samtools1.18软件进行了从头组装，得到了RNMV Arg1分离株的近乎完整基因组（RNA1：7126个核苷酸，平均覆盖率为285.9%（正义链）和83.5%（反义链）；RNA2：3587个核苷酸，平均覆盖率为364.7%（正义链）和232.3%（反义链）；图1A和B），其G+C含量分别为44.2%和41.7%。在映射到RNMV的18–28nt sRNA中，以21nt和22nt长度的sRNA为主（图1C），这与植物细胞在RNA病毒感染时产生的小干扰（si）RNA的生成机制一致（9）。

图1

图1 RNMV的基因组结构；从阿根廷科连特斯省采集的病株中分离出的病毒小RNA（sRNA）的主要特征；以及系统发育重建结果。映射到RNMV参考基因组的小RNA数量分布：RNA1（A）和RNA2（B），其中轴线上方的数值代表从相应位置开始的正义链（蓝色）读段，下方的数值代表结束于相应位置的反义链（红色）读段。C）显示了RNA1（黑色）和RNA2（灰色）RNMV基因组映射读段的长度分布。RNA1（D）和RNA2（E）的系统发育树是通过MEGA12软件使用最大似然法（基于74个Bymovirus分离株的基因组序列，包括Bymovirus oryzae种、Bymovirus hordei种、Bymovirus avenae种、Bymovirus hordeiluteum种、Bymovirus tritici种和Bymovirus triticitessellati种）构建的。

Arg1基因组与RNMV在核苷酸（nt）和氨基酸（aa）水平上的相似度很高（分别为79.5%和95.1%；RNA1和RNA2分别为93.7%和96.9%），而与其他Bymovirus属物种的相似度较低（分别为>61.4%和>65.4%；RNA1和RNA2分别为>55.0%和>37.4%）。这些结果得到了系统发育重建的支持（图1D和E）。具体来说，Arg1分离株的衣壳蛋白与GenBank数据库中仅有的两个RNMV序列（LC055681.1和U95205）在核苷酸水平上的相似度分别为81.4%和94.7%（7，11），在氨基酸水平上的相似度分别为91.3%和99.0%（11）。这些数值超过了Potyviridae科的物种界定阈值（12）。因此，尽管RNMV目前仅在亚洲有报道（1，7，11，13），但我们的研究结果表明这种病毒也存在于阿根廷的水稻田中。

致谢

本项工作得到了CONICET外部奖学金计划、MUSE EXPLORE#3项目（I-SITE MUSE）、Ecos-Sud项目（法国-阿根廷A22B02）、CONICET（PIP 2022-2024 - 11220210100693CO）、Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica（PICT-2020-1819）、INTA学科项目（2023-PD-L01-I083；2023-PD-L03-I084）以及法国国家研究机构（ANR JCJC SPADYVA；ANR-20-CE35-0008-01）的财政支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析，也未对论文的发表决定施加任何影响。