从德克萨斯州卢博克市的表土中分离出一种名为Gordonia rubripertincta的噬菌体BluerMoon

《Microbiology Resource Announcements》：Isolation of a Gordonia rubripertincta bacteriophage, BluerMoon, from topsoil in Lubbock, Texas

本研究通过SEA-PHAGES项目从美国德克萨斯州拉博克土壤中分离并测序了一株DJ聚类噬菌体BluerMoon，基因组长度61,118 bp，含90个预测基因，证实其属裂解型噬菌体，并利用多工具验证基因功能。

　　

摘要

我们分离、注释并分析了一种环境噬菌体的基因组。BluerMoon是在德克萨斯州卢博克的表土中发现的，这是科学教育联盟-噬菌体猎人推动基因组学和进化科学（SEA-PHAGES）项目的一部分。根据Actinobacteriophage数据库PhagesDB（https://phagesdb.org）的分类，BluerMoon属于DJ簇。

公告

Gordonia rubripertincta是一种革兰氏阳性细菌，属于放线菌门（1），常见于土壤中，并具有生物修复潜力（2）。通过科学教育联盟-噬菌体猎人推动基因组学和进化科学（SEA-PHAGES）项目，G. rubripertincta被用作宿主细菌，用于从德克萨斯州卢博克收集的土壤样本中分离、鉴定、测序和注释噬菌体（3）。

BluerMoon是在2023年8月30日，从坐标为33.58482,-101.87825处的土壤样本中提取的。该样本被悬浮在蛋白胨酵母钙（PYCa）培养基中，并以2,000 × g（3,500 rpm）的离心速度离心10分钟。通过0.22-μm注射器过滤器过滤掉杂质，然后取500 μL上清液加入到G. rubripertincta NRRL B-16540的液体培养基中。富集后的分离样本在30°C下以220 rpm的转速孵育3天，随后稀释并通过覆盖技术进行接种（4）。选取一个透明的噬菌斑，将其悬浮在400 μL PYCa培养基和400 μL 80%甘油溶液中。接着，将10 μL该混合液加入到3 mL PYCa培养基中。从这10 μL溶液中取出1 μL、10 μL或100 μL，分别与250 μL宿主细菌和3 mL熔化的顶层琼脂混合，使用覆盖技术制备出网状（网状）平板（用于高滴度溶菌液，>1 × 10⁹ pfu/mL）（4）。样本的DNA使用Quantabio Extracta Plus DNA试剂盒（目录号95213-050）进行处理。使用BioTek Take3平板读取仪测量DNA浓度。Illumina DNA Prep标签化试剂盒用于准备基因组，以便在Illumina NextSeq 2000平台上进行测序，使用300循环的流动细胞试剂盒生成2 × 150 bp的配对读段。

使用Bowtie2 v2.5.3和一种密切相关的宿主序列（登录号CP136136.1）（5）去除宿主序列污染。使用Fastp v0.23.4（6）检查读取质量。使用SPAdes genome assembler v3.15.5进行基因组组装（7）。使用BEDTools v2.31.0和SAMtools v1.6（8, 9）确定深度和覆盖度。使用DNA Master v5.23.3和Phage Evidence Collection and Annotation Network（PECAAN）（10, 11）完成基因组注释。在注释过程中，使用Glimmer v3.0和GeneMark v2.5手动验证和预测基因（12）。利用BLAST v2.11.01（13）（参考PhagesDB.org和NCBI非冗余数据库）、Phamerator（14）（使用Actino_draft数据库v578）、NCBI保守结构域数据库（15）、HHPRED v3.0（16）（使用PDB_mmCIF70）和Pfam-v36.0（17）预测基因功能。所有提到的软件均使用默认配置（表1）。

表1

表1 所报道噬菌体的特征

参数	分离出的噬菌体BluerMoon的数据
基因组长度（bp）	61,118
测序覆盖度（x）	2,424
预测基因数量	90
tRNA数量	0
未知功能的假设蛋白数量	65
GC含量（%）	68.8%
进行测序的机构	SeqCoast Genomics
GenBank登录号	PV251866
SRA登录号	SRR31925873
BioProject登录号	PRJNA488469

BluerMoon是从G. rubripertincta的富集培养物中分离得到的。根据Actinobacteriophage数据库PhagesDB（https://phagesdb.org），BluerMoon属于DJ簇，且具有裂解性。DJ簇噬菌体的平均GC含量为51.5%，平均基因组大小为60,476 bp，可感染Gordonia属细菌。我们手动将其分类为具有3’末端粘性突出结构的基因组（18）。通过tRNAscan-SE v2.0和ARAGORN v1.2.38确认BluerMoon中不存在tRNA，这与DJ簇中的所有噬菌体一致（19, 20）。

致谢

我们感谢Denise L. Monti、Maggie D. Viland、C.M. Lewis、Rebecca A. Garlena、Daniel A. Russell、Deborah Jacobs-Sera和Graham F. Hatfull对基因组质量控制的支持。同时感谢SEA-PHAGES项目的教师团队以及Katie Starr和Christopher Marpa的支持，还有Enoch Ghosh在手稿审阅期间的帮助。

我们的工作得到了SEA-PHAGES项目以及霍华德·休斯医学研究所的支持。

我们还要感谢德克萨斯理工大学教学、学习与专业发展中心（TLPDC）和转型本科体验中心（TrUE Scholars）在SEA-PHAGES项目实施过程中提供的支持和帮助。