产生麦角肽的Bacillus mobilis菌株的完整基因组

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome of a cereulide-producing Bacillus mobilis strain

本研究的产毒芽孢杆菌BfR-BA-01700分离自德国2021年肉类沙拉样本，经基因测序证实属于panC clade 2，与B. mobilis亲缘关系最近（ANI 99.9%）。其携带的349,073 bp质粒编码的cesHPTABCD毒素基因簇，与参考菌株AH187的基因匹配度达99.9%-100%。研究采用短读Illumina测序和长读Nanopore测序技术，结合BakCharak分析平台完成基因组组装与特征分析。

　　

摘要

迄今为止，已报道的产生雪腐菌素的Bacillus cereus菌株属于panC分支3或6，并且与B. paranthracis或B. mycoides具有最高的平均核苷酸同一性（ANI）。在这里，我们报告了一种属于panC分支2的催吐菌株，其ANI与B. mobilis物种相同。

公告

Bacillus cereus菌群包含能够产生导致食物中毒的催吐毒素雪腐菌素的菌株。产生雪腐菌素的遗传前提是cesHPTABCD基因簇。大多数已描述的催吐性Bacillus cereus菌株为嗜温菌，属于系统发育上的panC分支3，与B. paranthracis物种具有最高的平均核苷酸同一性（ANI），并且将ces基因携带在一个270 kb的质粒上（1–3）。极少数情况下，会检测到耐寒的催吐菌株（属于panC分支6，与B. mycoides的ANI最高）（4–6）。

本研究中描述的催吐菌株BfR-BA-01700是根据ISO 7932-2004标准分离得到的，该方法是在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂上涂布样本后，在30°C下孵育24至48小时而获得的，样本来自2021年德国某地食品控制机构采集的肉沙拉样本。该菌株属于panC分支2，与B. mobilis的ANI最高。该菌株产生雪腐菌素的能力此前已有报道（7）。cesHPTABCD基因簇位于一个349,073 bp的质粒上。使用NCBI BlastN进行比对后发现，经典的270 kb pCER270质粒（菌株AH187；GenBank登录号：DQ889676.1）的序列与该质粒的同一性达到99.96%（查询覆盖率为90%）。

基因组分析采用了Illumina的短读长测序技术和Oxford Nanopore Technologies的长读长测序技术。DNA提取时，将菌株从-80°C的甘油培养物中划线接种到羊血琼脂上。从单个菌落中提取的样本用于接种3 mL的脑心浸液培养基（Oxoid），并在30°C、150 rpm条件下培养过夜。随后使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen，德国Hilden）提取DNA，并直接用于测序，无需进一步处理或DNA大小筛选。

对于短读长测序，使用了Nextera DNA Flex试剂盒（Illumina，美国加州圣地亚哥），在Illumina NextSeq 500仪器上进行2×149 bp的循环测序，共获得2,832,646条原始读长数据。使用了AQUAMIS v1.2.0-18-g1317d15流程进行数据修剪、质量检测和de novo组装（8）。

对于ONT长读长测序，使用了SQK-RBK110.96试剂盒（Oxford Nanopore Technologies，英国牛津）来制备测序文库。文库使用FLO-MIN106流式细胞仪和MinIon Mk1C设备进行测序。生成的数据随后使用guppy v6.0.1在SUP模式下进行碱基呼叫，得到141,748条原始读长数据（https://nanoporetech.com/community）。获得的数据经过质量控制后，使用MilongA流程v1.0.1进行组装（https://gitlab.com/bfr_bioinformatics/milonga）。在此过程中，使用Porechop v0.2.4（https://github.com/rrwick/Porechop）对读长数据进行修剪，并进一步使用NanoFilt v2.8.0和NanoStat v1.5.0进行处理和评估（9）。短读长和长读长数据集使用Unicycler v0.4.8进行de novo组装和环化，同时使用Pilon进行数据优化（10–12）。

基于此组装结果，我们使用BakCharak v3.1.6流程进行了进一步的特征分析（13）。注释工作在NCBI上使用PGAP工具完成（14–16）。

特征分析结果以及读长质量控制、组装过程和所用工具的详细信息总结在表1中。

表1

表1 催吐性B. mobilis菌株的遗传特征及所用工具和数据库

	菌株BfR-BA-01700	工具和数据库（所有工具均使用默认设置）
短读长质量控制	2,755,852条读长数据（修剪后）；88% ≥ Q30	AQUAMIS v1.2.0-18-g1317d15（8），使用fastp v0.19.5（17）
长读长质量控制	71,429条读长数据（修剪和过滤后）；N50：6,313 bp	Porechop v0.2.4（https://github.com/rrwick/Porechop），NanoFilt v2.8.0 & NanoStat v1.5.0（9）
组装	GCA_033841795.2（完整，七个contigs）

1.

CP185965.1：染色体；5,277,139 bp；环状；%GC：35.5

2.

CP185966.1：质粒；349,073 bp；环状；%GC：34

3.

CP185967.1：质粒；66,276 bp；环状；%GC：32

4.

CP185968.1：质粒；52,852 bp；环状；%GC：36.5

5.

CP185969.1：质粒；41,501 bp；环状；%GC：32.5

6.

CP185970.1：质粒；32,086 bp；环状；%GC：35.5

7.

CP185971.1：质粒；3,166 bp；环状；%GC：33

MiLongA流程1.0.1（https://gitlab.com/bfr_bioinformatics/milonga），
Unicycler v0.4.8（11, 12），
Pilon v1.24（10），platon v1.6（18），
Geneious Prime 2020.2.2基于ANI的物种鉴定ANI覆盖率：92%
ANI值：99.9
最佳ANI参考菌株：B. mobilis 0711P9-1（模式菌株）BakCharak流程v3.1.6（13），使用FastANI v.1.33（19）和BTyper v.3.4.0的类型菌株数据库（20）panC分支分支2（传统分类及调整后的分支)BakCharak流程v3.1.6（13），使用abricate v1.0.1（https://github.com/tseemann/abricate）和panC数据库（20）16s rRNA基因和cspA基因的特征16s rRNA基因：嗜温菌特征；cspA基因：嗜温菌特征BakCharak流程v3.1.6（13），使用bakter v1.9.3（21）以及根据22和23提供的嗜温菌和耐寒菌的特征序列来分析cspA基因和16s rRNA基因MLST784BakCharak流程v3.1.6（13https://github.com/tseemann/mlst）和PubMLST数据库（2024-01-16（24）cesHPTABCD基因簇位置：349,073 bp质粒
与参考菌株AH187的基因序列的覆盖率和同一性：cesH：100%和100%cesP：100%和100%cesT：100%和100%cesA：100%和100%cesB：100%和100%cesC：100%和99.89%cesD：100%和100%BakCharak流程v3.1.6（13https://github.com/tseemann/abricate）和VFDB（SetB）数据库（2022-08-26（25）