来自缺氧海洋沉积物中的反硝化细菌Roseovarius pacificus IR27的基因组序列，该细菌具有多种甲胺氧化途径

《Microbiology Resource Announcements》：Genome sequence of Roseovarius pacificus strain IR27, a denitrifying bacterium from anoxic marine sediments with multiple methylamine oxidation pathways

海洋沉积物中单甲基胺氧化反硝化细菌Roseovarius pacificus IR27基因组测序及功能分析。采用纳米孔测序技术完成染色体（3,527,725 bp）和质粒（272,010 bp）组装，基因组包含反硝化酶系统（cd1 nitrite reductase、NOR、NOR）及单甲基胺代谢相关基因簇，并首次发现质粒携带铜依赖性硝酸盐还原酶。

　　

摘要

我们报告了从富含单甲基胺和一氧化二氮的缺氧海洋沉积物中分离出的Roseovarius pacificus IR27菌株的基因组序列草图。该菌株的染色体长度为3,527,725 bp（GC含量为62.56%），质粒长度为272,010 bp（GC含量为59.18%）。基因组中包含参与反硝化作用以及单甲基胺氧化的基因。

公告

Roseovarius属属于Rhodobacteraceae科，其成员分布于多种海洋生境中（1, 2）。我们于2021年9月从季节性缺氧的Grevelingen湖（位于北纬51.742°、东经3.849°）的沉积物中分离出IR27菌株（沉积物深度为5–10厘米，3, 4）。在缺氧条件下，将沉积物与人工海水（ASW）按1:10的比例混合，其中单甲基胺（MMA）作为唯一的碳源和氮源，一氧化二氮（N₂O）作为电子受体。培养瓶在约22°C、100 rpm的条件下进行培养，并在底物耗尽时及时补充。经过多次转接至改良的ASW培养基（t-ASW，含有0.050 mM K₂HPO₄、0.010 mM Na₂S、1 mL/L微量元素[DSMZ SL-10（改良成分：20 mg/L H₃BO₃、170 mg/L CuCl₂ · 2H₂O、67 mg/L SeO₂、240 mg/L CeCl₃ · 7H₂O、50 mg/L Na₂WO₄ · 2H₂O]以及1 mL/L维生素溶液[DSMZ 141（改良成分：0.2 mg/L维生素B₁₂]）后，将富集的菌株接种在t-ASW琼脂（15 g/L）和1.2 mM MMA上。培养板在密封容器中于约22°C、含4.5% N₂O的条件下进行培养。根据菌落形态特征鉴定出IR27菌株，并对其基因组进行测序以研究其代谢能力。

基因组DNA使用DNeasy PowerSoil Pro Kit（Qiagen，荷兰Venlo）从多个菌落中提取，并采用Nanopore长读长技术进行测序。DNA文库构建按照Oxford Nanopore Technologies提供的Native Barcoding Kit 24 V14（SQK-NBD114-24）说明书进行，但在样品中加入了AMPure XP磁珠（体积比为0.4:1.0）。文库被加载到Flow Cell（R10.4.1）上，并使用MinION Mk1C设备进行测序。碱基比对使用Dorado（model dna_r10.4.1_e8.2_400bps_sup@v5.0.0）软件完成。共获得482,977条测序读段，其质量通过FastQC（v.0.11.9，https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）进行分析。读段（N50：7,887）使用BBduk（BBTools v.39.19；参数：qtrim = rl, trimq = 20, minlen = 100）进行修剪，并使用Flye（v.2.9；参数：--nano-raw, --meta 5）进行组装。Flye分析结果显示，所得基因组包含一个环状染色体（3,527,725 bp；GC含量62.56%），覆盖度为734倍；以及一个较小的环状基因组（272,010 bp；GC含量59.18%），覆盖度为815倍。使用CheckM（v.1.2.2 6）对染色体进行质量评估，结果表明组装完成度为99.25%，污染率为0.00%。通过Genome Taxonomy Database Toolkit（v.2.4.1 7）进行分类鉴定，该菌株属于Roseovarius pacificus，与R. pacificus标准菌株（GCA_900142665.1）的核苷酸同源性评分平均为95.93%（通过fastANI（v.1.33 8验证）。基因组使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline（6.10 9）进行注释，共预测出3,772个基因。较小基因组上存在质粒复制基因（repABC），这证实了其质粒性质，这一特征此前已在R. pacificus及其他Roseovarius物种中观察到2, 10）。

基因组中含有将亚硝酸盐还原为氮气的反硝化相关基因簇，包括细胞色素cd1亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和一氧化二氮还原酶。质粒还携带一种含铜的亚硝酸盐还原酶。未检测到硝酸盐还原酶基因簇。与其他Roseovarius菌株类似，IR27菌株能够将反硝化作用与单甲基胺氧化过程联系起来。基因组中还包含三个与肌苷酸氧化酶（soxABCD）相关的基因簇，该酶在N-甲基谷氨酸代谢途径中起关键作用11。此外，基因组还编码甘氨酸裂解途径及相关的一碳代谢基因。

致谢

本研究得到了ERC Synergy项目MARIX（854088）的资助。

作者感谢团队成员在采样和讨论中的协助。