从一名处于缓解期的溃疡性结肠炎患儿粪便中分离出的Agathobacter rectalis H10.1的基因组序列草图

《Microbiology Resource Announcements》：Draft genome sequence of Agathobacter rectalis H10.1 isolated from the feces of a child with ulcerative colitis in remission

本研究完成溃疡性结肠炎缓解期患者分离菌株Agathobacter rectalis H10.1的全基因组测序，分析其基因组特征、注释及系统发育，验证物种分类地位，为肠道菌群研究提供新资源。

　　

摘要

Agathobacter rectalis是一种有益的肠道细菌，已知能够产生丁酸，从而改善肠道健康。本文报告了从一位处于临床缓解期的溃疡性结肠炎患者粪便中分离出的A. rectalis H10.1菌株的基因组序列草图。

公告

Agathobacter (Eubacterium) rectalis在结肠抗性淀粉（RS）的发酵过程中起着关键作用，它将其他细菌产生的淀粉分解产物转化为短链脂肪酸，尤其是丁酸（1）。与健康个体相比，炎症性肠病（IBD）患者的A. rectalis相对丰度较低（2）。从一位处于临床缓解期的溃疡性结肠炎患者粪便样本中分离出了一个A. rectalis菌株。样本收集获得了安大略省东部儿童医院研究伦理委员会的批准（REB#20/16E）。在获得同意后，患者在家中采集了粪便，并将其置于脱氧无菌缓冲液（1× PBS + 10% wt/vol甘油，0.1% wt/vol L-半胱氨酸盐酸盐，pH 7.6）中送回实验室。样本被搅匀成20% wt/vol的粪便浆液，通过离心去除非细菌杂质，然后分装并在?80°C下保存（3, 4）。细菌分离方法包括将300 μL粪便浆液在厌氧条件下（5% CO₂、5% H₂和90% N₂）于1 mL基础培养基（5）中孵育4小时，并添加1.5% ActiStar RT。孵育后，按照先前描述的方法分离出与RS相关的细菌（6）。具体步骤为：首先将RS颗粒在700 × g的离心力下多次离心，然后用PBS洗涤以分离特异性附着在RS颗粒上的细菌。洗涤后的RS颗粒重新悬浮在无菌PBS中，涡旋后接种到ATCC 1703培养基平板上，并在37°C下厌氧孵育24小时。选取一个单克隆菌落，并在相同条件下通过三次连续划线培养在ATCC 1703琼脂平板上纯化，命名为H10.1菌株。

纯化的H10.1菌株在37°C的ATCC 1703肉汤培养基中厌氧培养，然后使用Quick-DNA HMW试剂盒（ZymoBIOMICS, D6060）按照制造商说明提取基因组DNA。未剪切且未经大小筛选的DNA用于生成标签化文库，每个文库重复三次，并使用Rapid Barcoding Kit（ONT, SQK-RBK114-24）进行标记，随后在MinION测序仪上使用单个流式细胞（ONT, FLO-MIN114）进行72小时测序。后续的生物信息学分析使用各程序的默认参数，除非另有说明。原始读段经过碱基校正、适配子修剪和去多重化处理（使用Dorado v0.9.2，https://github.com/nanoporetech/dorado），采用高精度（hac）模型减少错误。低质量读段（Q分数< 8）被丢弃。技术重复数据合并后，共有370,004个读段（N₅₀ = 6,800 bp）用于使用Flye（v2.9.3-b1797）进行de-novo组装（7），并利用Flye内置的错误校正模块。使用Medaka（v1.8.1）对基因组进行优化，然后用QUAST（v5.0.2）（8）评估组装质量。基因组完整性通过BUSCO（v5.8.2_cv1）（9）进行评估。

H10.1的基因组草图由四个contig组成，详见表1。使用NCBI的原核生物基因组注释流程（v6.10）（10）进行注释后，发现该基因组包含2,966个蛋白质编码序列、78个RNA基因（15个rRNA、59个tRNA和4个ncRNA）以及97个假基因。通过FastANI（v1.34）（11）确认H10.1属于A. rectalis，其与ATCC33656参考基因组（NC_012781.1）的核苷酸同源性为96.88%。H10.1的系统发育关系通过Type (Strain) Genome Server中的全基因组分类分析得到验证，并使用iTOL（v6）（13）可视化（图1）。

表1

表1Agathobacter rectalis H10.1的基本基因组特征

>平均覆盖率 >BUSCO完整性（%）

参数	值
基因组大小（bp）	3,233,719
Contig数量	4
最大contig长度（bp）	3,222,615
N50	3,222,615
GC百分比（%）	41.93
303
97.1

图1

图1Agathobacter rectalis H10.1和Agathobacter rectalis菌株的系统发育树。该树使用FastME 2.1.6.1（14Flavonifractor plautii的GBDP距离计算得出。分支长度根据GBDP距离公式d5进行缩放。分支上方的数字表示100次重复实验中GBDP伪Bootstrap支持值大于60%的情况，平均分支支持率为22.8%。树以中间点为根（15）。

致谢

本研究得到了加拿大政府（通过Genome Canada和Ontario Genomics Institute (OGI-149)、加拿大卫生研究院（ECD-144627）以及安大略省经济发展与创新部（项目13440）的资助。此外，加拿大数字研究联盟（alliancecan.ca）（RRG #5010）也为本研究提供了支持。