关于小龙虾（Cherax quadricarinatus）眼柄-雄激素腺-睾丸轴之间相互作用的分子机制研究

《Aquaculture Reports》：Molecular insights into the interconnections in the eyestalk-androgenic gland-testis axis in crayfish Cherax quadricarinatus

本研究以中华绒螯蟹为对象，通过RNA测序和基因沉默实验，解析眼柄-雄性腺-睾丸轴（EG-AG-T）在发育中的分子调控网络。发现两者存在47个跨阶段差异表达基因及6个共表达簇（2111基因），揭示正负调控关系：C8簇涉及神经发生和钙信号通路，C17、C20簇显示负相关。实验证实IAG敲低对DMRT3和FOXL2表达无显著影响，但共表达基因富集于生殖过程和能量代谢。研究成果为甲壳类人工育种提供了分子靶点。

　　
该研究聚焦于中华绒螯蟹（*Cherax quadricarinatus*）眼柄-雄性腺-睾丸轴（EG-AG-T）的分子调控机制，通过转录组测序和基因沉默实验，揭示了该轴在性发育中的复杂网络。研究团队系统采集了青年、成年三个发育阶段的样本，对眼柄和雄性腺进行RNA测序，共获得15,028个可表达基因，并运用差异表达分析和共表达聚类技术，识别出47个全阶段共表达基因、2111个眼柄与雄性腺共表达基因簇，以及2337个与已知性调控基因（如IAG、FOXL2、DMRT3等）共表达的基因网络。

### 关键发现与机制解析
1. **全阶段共表达基因的保守调控功能**
47个基因在青年至成年阶段持续表达差异，其中23个与激素信号通路相关（如17β-羟类固醇脱氢酶6、甾醇急性调节蛋白），15个涉及生殖细胞分化和DNA重组（如Vasa-like、TDRD1）。这些基因在能量代谢（如柠檬酸合酶、三羧酸循环酶）、离子通道（如电压门控钙通道亚基）等基础生理过程中呈现协同调控，暗示EG-AG-T轴通过整合代谢稳态实现性发育的时序控制。

2. **共表达基因簇的生物学意义**
- **C8簇（正共表达）**：包含375个基因，显著富集于神经发生（如NeuroD1-like）、钙信号转导（如TRPV通道蛋白）和细胞分化（如MyoD同源蛋白）。该簇在成年阶段眼柄与雄性腺中表达同步性最高，可能通过调控神经-内分泌对话影响雄性腺的形态建成。
- **C20簇（负共表达）**：包含289个基因，功能集中于细胞骨架组织（如肌动蛋白相关蛋白）和囊泡分泌（如分泌颗粒膜蛋白）。负相关性暗示眼柄与雄性腺在激素分泌策略上存在竞争性调控，例如眼柄分泌的抑制因子可能通过阻断雄性腺的激素合成来调节性平衡。

3. **IAG沉默实验的启示**
在成年个体中，通过靶向注射IAG dsRNA，发现雄性腺IAG表达量降低78%，但DMRT3、FOXL2等性决定基因未受显著影响。这表明IAG可能通过非直接转录调控（如表观修饰或信号级联）作用于生殖细胞分化。进一步分析显示，IAG共表达基因中MITF-like（黑素细胞相关转录因子）和SOX9（骨骼发育因子）的表达量与IAG呈正相关，提示IAG可能通过激活MITF-SOX9通路调控精子发生。

4. **CFSH/IAG负反馈调控的分子基础**
研究发现CFSH（雌性性激素）与IAG存在组织特异性负调控：在眼柄中CFSH高表达阶段（如蜕皮期），其共表达基因（如MIH、CHH2）显著抑制IAG合成。通过质谱分析证实，CFSH能通过激活PI3K/AKT通路下调IAG前体蛋白的翻译效率，而这一过程可能依赖于RGS蛋白（G蛋白偶联受体抑制因子）的介导。

### 创新性突破与学术价值
1. **发现新型生殖调控因子**
-鉴定出MAG（膜锚定雄性腺特异性蛋白），其基因产物与IAG形成复合体，通过抑制蛋白酶C活性维持雄性腺细胞存活。
-发现VASA-like基因与线粒体功能密切相关，其沉默会导致雄性腺细胞线粒体膜电位下降（ΔΨm降低约35%），并伴随精子发生停滞。

2. **信号通路的跨轴整合机制**
研究揭示眼柄-雄性腺轴通过钙-谷氨酰胺循环系统实现双向调控：
- 眼柄分泌的CHH通过激活TRPV1通道（瞬时受体电位 vanilloid 1）增加胞内钙浓度，触发雄性腺分泌IAG的神经-激素级联反应。
- 雄性腺合成的IAG通过抑制Calcineurin（钙调磷酸酶）活性，防止眼柄过度释放MIH（蜕皮抑制激素），形成负反馈平衡。

3. **表观遗传调控的潜在作用**
基于Hi-C数据补充分析发现，在眼柄-雄性腺边界区域存在大量CTCF结合位点（约120个），这些区域在发育早期呈现高甲基化状态，可能通过印记调控机制决定组织特异性基因表达。例如，FOXL2启动子区域的H3K27me3水平在雄性个体中比雌性高2.3倍，且与IAG表达呈显著负相关。

### 应用前景与局限性
1. **人工繁育技术突破**
- 通过CRISPR-Cas9敲除C8簇中的NeuroD1基因，可使中华绒螯蟹雄性率提升至92.3%（对照为85.7%）。
- 过表达MAG基因的雄性蟹在30天养殖周期中体长增长率提高18.6%，且精子活力提升至行业标准的1.5倍。

2. **研究局限性**
- 当前测序深度（150bp PE reads）无法完全解析IAG基因的剪接变体（已知存在7种剪接形式）。
- 动物福利委员会对实验用蟹的麻醉方案（异氟烷浓度>2%）可能影响神经激素分泌水平，需采用靶向转录组学（Targeted RNA-seq）进行验证。

3. **后续研究方向**
- 构建眼柄-雄性腺-睾丸轴的时空基因表达图谱（计划使用10x Genomics单细胞测序技术）。
- 开发基于纳米颗粒递送系统的靶向RNA干扰疗法，优化IAG调控效率（已申请发明专利ZL2025XXXXXX.9）。

### 结论
本研究系统揭示了眼柄-雄性腺-睾丸轴的分子调控网络，发现IAG通过激活线粒体ATP5A复合体（ω-亚基mRNA表达量上调3.2倍）为精子发生提供能量支撑，同时CFSH通过抑制MAG的表达维持雌性表型。这些发现不仅完善了甲壳类动物性发育的理论框架，更为设计"性别逆转"和"多倍体育种"技术提供了分子靶点，对提升水产养殖经济效益具有指导意义。