基于微管靶向策略的卢佩醇衍生物的开发：结构修饰与抗肿瘤活性的相关性分析

《Bioorganic Chemistry》：Development of lupeol derivatives based on tubulin-targeting strategy: structural modification and correlation analysis of antitumor activity

天然产物Lupeol衍生物抗肿瘤活性及机制研究。设计合成两类新衍生物（3-丙烯酸酯和3-哌嗪羧酸酯），体外对A549、HepG2、MCF-7细胞抑制率达78%-95%，其中5l对A549 IC50 1.84±0.53μmol/L，选择性指数15.39。通过分子对接证实5l特异性结合β-微管冷杉醇结合位点（结合能-13.40 kcal/mol），抑制微管聚合，诱导G2/M期阻滞和凋亡通路激活。体内实验显示5l显著抑制小鼠肺癌模型肿瘤生长（抑瘤率62.3±4.1%，体重下降率降低38.5%），呈现良好安全窗。为微管靶向药物开发提供新策略。

　　

赵寅旭|侯丽曼|田双|朱梦欣|吴佳乐|马玉坤|卜明|林宇

齐齐哈尔医科大学药学院，中国黑龙江省齐齐哈尔市161006

摘要

卢佩醇（Lupeol）是一种天然五环三萜化合物，在开发新型抗肿瘤药物方面具有巨大潜力。为了进一步提高其抗肿瘤活性和靶向能力，本研究设计并合成了一系列新的卢佩醇衍生物，并评估了它们对三种人类癌细胞系（A549、HepG2和MCF-7）的增殖抑制作用。在这些衍生物中，化合物5l对A549细胞的体外增殖抑制作用最强，半数抑制浓度（IC₅₀）为1.84±0.53 μmol/L，选择性指数（SI；IC₅₀（人胚胎肺成纤维细胞MRC-5/IC₅₀（A549细胞））为15.39。机制研究表明，化合物5l是一种新型的微管抑制剂：它能够特异性结合β-微管的秋水仙碱结合位点，结合能为?13.40 kcal/mol，有效抑制微管聚合，使细胞周期停滞在G2/M期，并同时触发一系列与凋亡相关的反应，从而显著诱导肿瘤细胞凋亡。在小鼠肺癌模型中，化合物5l表现出显著的抗肿瘤活性和良好的安全性。基于这些结果，化合物5l作为治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的新微管抑制剂具有很大潜力。

引言

癌症仍然是全球第二大死亡原因。当前的癌症治疗方法仍面临诸多挑战，包括药物耐药性、不良反应和高复发率。1., 2., 3., 4., 5. 天然产物在癌症治疗中具有独特优势，包括抗增殖作用和重塑肿瘤微环境的能力。此外，它们还是药物发现的重要分子支架。因此，从天然产物中开发新型、高效且毒性较低的抗肿瘤剂是目前研究的重点。6., 7., 8., 9., 10.

微管在维持细胞形态、细胞内运输和细胞周期调节等基本生物过程中起着核心作用。11., 12., 13., 14., 15., 16. 因此，在抗癌研究中，与微管相互作用的天然产物（如微管稳定剂，如紫杉醇和长春碱类衍生物）通过调节微管动态发挥抗肿瘤作用。17., 18., 19. 三甲基氧基苯基（TMP）结构是微管结合的关键药效团，^20,21例如秋水仙碱结合位点抑制剂（CBSIs，A）、鬼臼毒素（B）和Combretastatin A-4（CA-4，C）（图1）。通过结合秋水仙碱位点，TMP结构有效抑制微管聚合，导致细胞周期停滞并阻止有丝分裂纺锤体组装。22., 23., 24., 25. 研究表明，查尔酮（D）与微管相互作用并烷基化多个关键位点，从而抑制血管生成。这使肿瘤组织缺氧和缺乏营养，最终诱导肿瘤细胞死亡。^26,27 合成改性的查尔酮衍生物（E）和含硼化合物（F）显示出增强的肿瘤抑制能力（图1）。^28,29

含有哌嗪结构的化合物，如芳香酰胺衍生物（G）、N-酰基哌嗪衍生物（H）和N-杂环（4-苯基哌嗪基）酮（I），也通过靶向秋水仙碱位点有效抑制微管聚合，显著提高其抗肿瘤效果（图2）。30., 31., 32. 受到这些发现的启发，通过引入甲氧基、查尔酮、哌嗪等官能团对微管聚合抑制剂进行结构优化和合成，是一种提高其效力和选择性的有效策略。

卢佩醇（Lup，1）是一种天然存在的卢帕烷型三萜化合物，存在于可食用水果、蔬菜和药用植物中。^33,34 大量研究表明其对多种癌症（包括肝癌和肺癌）具有显著的抑制作用。^{35., 36., 37., 38., 39} 特别是Mohammad S.等人的研究⁴⁰发现，卢佩醇的部分抗肿瘤作用是通过靶向和调节微管功能实现的，从而诱导G2/M期细胞周期停滞。α,β-不饱和酮结构（Michael受体）是肉桂酸中的特征片段，也是秋水仙碱、紫杉醇和长春新碱等已知微管靶向剂中的关键药效团。⁴¹

基于这一知识，本研究首先在卢佩醇的C-3羟基引入丙烯酸侧链，合成了一系列卢佩醇-3-yl丙烯酸衍生物。随后，利用我们团队之前关于卢佩醇C-3位修饰的研究⁴²，设计并合成了第二系列新型卢佩醇衍生物：卢佩醇-3-yl哌嗪-羧酸酯。在这些化合物中，哌嗪-羧酸酯片段连接到卢佩醇的C-3位置，并在哌嗪环的末端氮原子上引入了含有Michael受体结构的丙烯酸取代基。这一策略旨在通过多种药效团的协同作用，增强卢佩醇的微管靶向亲和力，从而提高其在体外和体内的抗肿瘤效果。目标是为开发天然产物衍生的新型微管抑制剂提供实验基础。具体的结构修饰策略如图3所示。

部分内容摘录

卢佩醇-3-丙烯酸酯衍生物的合成

在本研究中，采用了图1所示的合成路线。以卢佩醇（1）为起始原料，在4-二甲氨基吡啶（DMAP）存在下，通过1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）催化，与肉桂酸衍生物进行酯化反应，得到了目标化合物（2a-m）。通过¹H NMR、¹³C NMR和HRMS对卢佩醇-3-丙烯酸酯衍生物2a-m进行了结构确认。

卢佩醇-3-(哌嗪)-丙烯酸酯衍生物的合成

基于图

结论

本研究以天然活性成分卢佩醇为先导化合物，通过合理的结构修饰策略设计并合成了两种类型的卢佩醇-3-(哌嗪基)丙烯酸酯衍生物。通过¹H NMR、¹³C NMR和HRMS等技术确认所有目标化合物的结构后，抗肿瘤活性评估显示，大多数衍生物的抗增殖活性显著增强。化合物5l在A549细胞上的IC??

一般实验程序

所有化学试剂均直接从知名供应商处购买，如Bellingway Technology Co., LTD.（北京）、Hyclone Inc.（美国）和Sigma Inc.（美国）。这些试剂未经进一步纯化即使用。熔点使用北京Titan Photoelectric公司制造的MP120自动熔点仪测定，未进行校正。化合物的光谱表征使用Bruker Avance DRX400 NMR仪进行。

CRediT作者贡献声明

赵寅旭：撰写——初稿、软件开发、方法学设计、实验实施。侯丽曼：撰写——初稿、数据验证、方法学设计、实验实施。田双：实验实施、数据分析、数据管理。朱梦欣：数据验证、软件开发、方法学设计。吴佳乐：数据可视化、软件应用。马玉坤：软件开发、方法学设计。卜明：撰写——审稿与编辑、项目管理、资金申请、概念构思。林宇：撰写——审稿与编辑、方法学设计、数据分析。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了齐齐哈尔医学科学院项目（QMSI2022Z-01）、黑龙江省博士后研究基金项目（LBH-QY24003）和齐齐哈尔医科大学优势学科建设项目（QYZDXK-001, QYZDXK-008）的资助。