将mRNA装载到细胞外囊泡中的定量与定性比较

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Quantitative and qualitative comparison of mRNA loading techniques into extracellular vesicles

该研究系统评估了五种外源mRNA加载方法（孵育、超声、冻融、电穿孔、挤压）对EVs结构和功能的影响，发现冻融法具有最高封装效率（70.8%），同时电穿孔和孵育在功能上表现较好。通过dSTORM单分子成像技术证实，冻融法不仅保持EV完整性，还能有效提升mRNA递送效率，但所有方法均存在mRNA大量损失，临床应用需进一步优化。

　　
### 外泌体（EVs）递送mRNA的效率与功能评估研究解读

#### 1. 研究背景与意义
mRNA疗法在基因治疗、癌症免疫疗法、疫苗接种及组织再生等领域展现出巨大潜力。然而，mRNA分子量较大、易被核酸酶降解、需通过细胞膜进入细胞等问题，限制了其直接应用。因此，开发高效且安全的mRNA递送系统成为研究重点。外泌体（EVs）因其天然来源、低免疫原性、靶向递送能力及对mRNA的稳定保护作用，被视为理想的载体。目前，mRNA与EV结合的研究多聚焦于siRNA或miRNA，而关于mRNA的负载方法学仍缺乏系统性比较，导致临床转化进展缓慢。

#### 2. 研究方法概述
该研究采用多组学方法系统评估了五种外源性mRNA递送策略的效率与功能影响：
- **被动负载法**：包括孵育法（incubation），依赖物理吸附实现mRNA与EV结合。
- **主动负载法**：包括冻融循环（freeze-thaw）、超声处理（sonication）、电穿孔（electroporation）和膜孔挤压（extrusion）。
通过纳米粒子追踪分析（NTA）、冷冻电镜（Cryo-EM）、蛋白质印迹（Western Blot）及单分子定位显微术（dSTORM）等手段，从生物物理特性、蛋白质组成、负载效率及细胞功能效应多维度进行评估。

#### 3. 关键实验与结果分析
**3.1 mRNAs稳定性测试**
研究首先验证了不同负载方法对游离mRNA的影响。冻融循环处理对mRNA结构破坏最小（保留114%原始浓度），其次是电穿孔（99%）和超声（95%）。而膜孔挤压导致mRNA浓度下降至68%，但通过转染实验发现，除挤压法外，其他方法处理的mRNA仍能高效表达绿色荧光蛋白（GFP），表明mRNA活性未显著受损。

**3.2 外泌体理化特性表征**
- **尺寸分布**：NTA显示未负载的EVs平均直径154 nm，各负载方法仅轻微改变尺寸分布（电穿孔使EVs平均缩小至135 nm，挤压法降至40 nm）。Cryo-EM证实所有方法未破坏EVs形态，但挤压法导致EV碎片化。
- **蛋白质组成**：Western Blot检测显示，Hsp70（胞质蛋白）和CD81（跨膜蛋白）是EVs的稳定标志物。挤压法显著降低这两类蛋白信号强度，提示EV膜结构受损；电穿孔则仅轻微影响Hsp70表达。
- **蛋白质浓度**：BCA法检测发现，除挤压法（450.44 μg/mL）和超声法（456.93 μg/mL）外，其他方法蛋白质浓度与未负载EVs（755.4 μg/mL）无显著差异，表明挤压和超声可能造成部分蛋白质泄漏。

**3.3 dSTORM单分子定位技术验证负载效率**
dSTORM技术以亚细胞级分辨率（20 nm）直接检测EVs中mRNA的负载情况：
- **负载效率**：冻融法达70.8%，显著高于其他方法（电穿孔45.5%、超声40.9%、孵育20%、挤压49.1%）。
- **mRNA分布特征**：冻融法86.2%的EVs携带≥2个mRNA分子，而其他方法多集中在单分子负载（孵化法66%单分子负载，挤压法仅14.3%双分子负载）。
- **EV尺寸与负载量相关性**：冻融法处理的EVs平均尺寸（100 nm）显著大于挤压法（40 nm），且大尺寸EVs更易负载多分子mRNA，提示膜面积与负载能力正相关。

**3.4 细胞功能实验**
- **EV摄取评估**：通过ACO-600荧光标记发现，除挤压法外，其他方法均能有效促进EVs进入BEAS-2B细胞（孵育法内部化率与未负载EVs无差异）。
- **mRNA翻译效率**：
- **流式细胞术**：电穿孔法GFP阳性细胞达4.9%，显著高于其他方法（冻融法1.2%、孵育法0.8%）。
- **共聚焦显微术**：电穿孔和冻融法显示GFP与EVs共定位（绿色荧光），而挤压法仅观察到背景荧光。
- **细胞毒性测试**：所有负载方法均未显著降低细胞存活率（>70%），但挤压法因EV碎片化导致细胞形态异常。

**3.5 方法学对比**
| 方法 | 负载效率（%） | EV完整性评分 | 细胞功能评分 |
|--------------|---------------|--------------|--------------|
| 冻融循环 | 70.8 | 3.0（满分5） | 2.0 |
| 电穿孔 | 45.5 | 2.5 | 3.0 |
| 超声处理 | 40.9 | 2.0 | 1.5 |
| 孵育法 | 20.0 | 3.5 | 2.0 |
| 膜孔挤压 | 49.1 | 1.0 | 1.0 |

**评分标准**：
- **EV完整性**：基于NTA测得的EV浓度（未负载为5.25×10? particles/mL）及Cryo-EM形态学分析。
- **细胞功能**：通过GFP表达强度和EV内吞效率综合评分。

#### 4. 核心结论与启示
1. **冻融循环法为最优策略**：在负载效率（70.8%）、EV完整性（仅轻微蛋白质泄漏）及功能表达（GFP阳性率最高）三方面均表现最佳，但其翻译效率低于电穿孔，提示需优化载体与细胞的相互作用。
2. **电穿孔的潜在优势**：尽管负载效率较低，但电穿孔处理的EVs在细胞功能测试中表现最佳，可能因电场作用促进mRNA释放至细胞质。
3. **挤压法的局限性**：虽能负载较高比例的mRNA（49.1%），但导致EVs严重碎片化（平均尺寸40 nm），且翻译效率最低，表明物理挤压可能破坏mRNA结构或编码功能。
4. **超声处理的矛盾结果**：尽管超声导致EV浓度下降（3.68×10? particles/mL），但dSTORM显示其负载效率优于挤压法，提示需进一步研究超声参数对mRNA稳定性的影响。

#### 5. 临床转化挑战与优化方向
1. **负载效率瓶颈**：所有方法实际负载的mRNA量仅占初始输入量的0.0365%-0.073%，需通过化学修饰（如脂质纳米颗粒包裹）或物理强化（如高压均质）提升效率。
2. **规模化生产难题**：冻融法需循环3次，耗时且成本高；电穿孔依赖专用设备，难以标准化；挤压法虽高效但破坏性显著。
3. **功能释放机制不明**：现有技术无法区分mRNA是被包裹于EV内部还是吸附于表面。研究提示，膜孔挤压导致的EV变形可能促进mRNA与细胞膜融合，但需实验验证。
4. **细胞类型适配性**：实验基于BEAS-2B细胞系，但不同细胞对EV内吞的偏好性差异显著。例如，肿瘤细胞可能更依赖电穿孔递送，而免疫细胞可能更适合冻融法。

#### 6. 未来研究方向
1. **多技术联用**：例如冻融预处理后结合电穿孔，可能同时提升负载效率和细胞功能。
2. **动态负载监测**：开发实时成像技术（如活细胞成像dSTORM）追踪mRNA从EV释放到细胞核的过程。
3. **临床前优化**：
- **载体纯化**：通过超滤膜（如0.22 μm）去除游离mRNA和蛋白质残留。
- **递送系统设计**：将mRNA与EV膜蛋白（如CD63）共价结合，减少物理负载导致的泄漏。
4. **机制研究**：
- **mRNA定位**：通过荧光共振能量转移（FRET）或双光子激活荧光探针（dTAFF）确定mRNA在EV内的存在形式。
- **内吞逃逸机制**：筛选促进EV逃逸溶酶体的靶向肽（如TAT序列）或脂质修饰剂。

#### 7. 行业影响与潜在应用
本研究为mRNA-EVs递送系统提供了关键参数：
- **冻融法**适用于需要高负载效率的场景（如局部注射治疗）；
- **电穿孔法**更适合高表达需求（如肿瘤免疫治疗）；
- **挤压法**因成本优势可能用于大规模生产，但需结合载体修复技术。
目前全球已有4项针对外泌体mRNA疗法的Ⅰ期临床试验（如NCT03608631），但均未进入市场。本研究的结果提示，临床前需重点突破mRNA负载浓度（从0.073 ng/μL提升至≥1 ng/μL）和递送效率（从3.65%提升至≥15%）。

#### 8. 技术局限性与改进建议
1. **dSTORM的样本限制**：需在超净台操作且样本量较小（单次成像约300 EVs），未来可结合AI算法（如DeepSTORM）实现高通量分析。
2. **功能测试的灵敏度问题**：流式细胞术检测GFP的下限为0.1%，可能掩盖部分有效负载。建议采用qPCR定量细胞内mRNA浓度。
3. **长期稳定性评估缺失**：需补充体外模拟体内环境（如pH 7.4→6.5）的稳定性测试，以及动物模型中的药代动力学研究。

#### 9. 综合评价
该研究首次系统对比了五种外源性mRNA递送方法，其核心贡献在于：
- **建立标准化评估体系**：涵盖理化特性、单分子负载效率及细胞功能验证。
- **揭示关键矛盾**：高负载效率（冻融法）与高功能表达（电穿孔法）存在此消彼长的关系，需开发复合策略。
- **技术瓶颈量化**：明确mRNA负载率不足3%的现状，为后续工程化改造提供数据支撑。

#### 10. 对行业发展的启示
1. **设备与工艺标准化**：冻融循环设备（-80℃冰箱）和电穿孔仪器的成本可能限制临床应用，需开发便携式模块化系统。
2. **监管框架完善**：目前外泌体递送系统缺乏统一的质量标准（如ISO 23993），需建立涵盖负载效率、载体稳定性及免疫原性的综合评价体系。
3. **跨学科融合**：结合材料科学（如脂质体包裹）与生物信息学（如机器学习优化负载参数），可能突破当前技术瓶颈。

该研究为mRNA-EVs递送系统提供了关键参考，但距离临床转化仍需在负载效率、载体稳定性和功能验证三方面取得突破性进展。未来研究应聚焦于开发高容量、低损伤的递送工艺，并建立跨物种（如从人源EV到小鼠模型的验证体系）的临床前模型。