鲍曼不动杆菌SK44产生的噬菌体尾刺蛋白所消化的五糖上的O-乙酰化作用，在触发促炎性免疫反应中起着关键作用

《Carbohydrate Polymers》：The O-acetylation on phage tail-spike protein digested penta-saccharide from Acinetobacter baumannii SK44 plays a critical role in triggering pro-inflammatory immune response

Acinetobacter baumannii SK44菌株外多糖经噬菌体尾尖蛋白降解后生成含O-乙酰基的五聚糖结构，通过激活TLR4受体诱导巨噬细胞释放IL-6和TNF-α炎症因子，其免疫效应与O-乙酰基密切相关。

　　

Tzu-Yin Huang|Yen-Ju Yang|Boh-Woon Tay|Chun-Ting Lin|Shih-Hsiung Wu|I-Ming Lee

台湾台北市中央研究院生物化学研究所

摘要

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种全球范围内对健康构成威胁的病原菌，因为它具有抗生素抗性，其细菌外多糖（exopolysaccharide, EPS）成为开发治疗替代品的候选物质。Ab-SK44株是一种具有较低抗生素抗性的临床分离株，其外多糖（EPS）可以被噬菌体尾刺蛋白（phage tail-spike protein, TSP）消化为五糖重复单元，该单元主要由三糖{→3)Gal(β1?→?6)Glc(β1?→?3)GalNAc(α1→}组成，同时两个分支结构上分别连接着GlcNAc3NAcA4OAc和GlcNAc。值得注意的是，TSP消化后的五糖能够刺激小鼠巨噬细胞Raw264.7释放白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），这一效果与Ab-SK44 EPS相似。敲低Raw264.7细胞上的Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）可减少细胞因子的释放，表明TLR4是Ab-SK44 EPS/TSP消化产物的关键受体。TSP消化后的五糖上的O-乙酰基可能与TLR4/髓系分化因子-2（Myeloid differentiation factor-2, MD2）复合体中的F126发生π-π堆积相互作用，从而激活免疫反应。本文探讨了细菌寡糖对免疫系统的刺激机制，并为针对病原菌感染的疫苗或免疫疗法提供了新的见解。

引言

鲍曼不动杆菌的感染引起了全球范围内的广泛关注，因为它是一种严重的健康威胁。这种革兰氏阴性菌可导致医院内感染，如呼吸机相关性肺炎、血流感染和脑膜炎（Chang等人，2009年；Cress等人，2014年；Eliopoulos等人，2008年）。由于抗生素的滥用，Ab菌容易从其他菌株中获得抗性基因，导致“最后一线”抗生素（如碳青霉烯类和多粘菌素）的效果逐渐减弱（Kyriakidis等人，2021年；Maragakis & Perl，2008年；Wu等人，2023年）。临床监测显示，重症监护病房中的免疫功能低下的患者常受到多重耐药（MDR）Ab菌的感染，进而引发医院暴发（Castanheira等人，2023年）。Ab菌的死亡率高达30%至75%，世界卫生组织将其列为“最高优先级病原体”（Hawkey等人，2018年；Howard等人，2012年）。因此，迫切需要了解其毒力因子并开发有效的Ab菌治疗方法。

细菌的外多糖（EPS）在致病性中起着关键作用，被视为有吸引力的治疗靶点。EPS覆盖整个细菌表面，可防止宿主免疫系统产生的致命血清因子或吞噬作用（Hidalgo-Cantabrana等人，2012年；Mizuno等人，2020年）。EPS还是生物膜细胞外基质的关键成分，有助于细菌附着在生物/非生物表面上。此外，EPS或其寡糖片段具有很高的免疫原性，能够诱导免疫反应，这可能有助于针对病原菌感染的疫苗或免疫疗法（Lee等人，2018年；Shao等人，2014年）。例如，来自肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）KN2株的六糖已被证明能诱导小鼠巨噬细胞释放白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α（Lee等人，2022年）。Ab-SK44株和ATCC 17978株的EPS也被报道具有生物活性（Lee等人，2017年；Singh等人，2018年）。细菌EPS通常通过与免疫细胞上的受体（尤其是Toll样受体TLRs）结合来触发免疫反应。TLR激活会招募细胞质适配蛋白TIRAP（含有Toll/IL-1R结构域的适配蛋白）和MyD88（髓系分化相关基因88），形成信号转导复合体（Kim等人，2023年；Xiang等人，2015年）。由此产生的细胞因子释放可进一步诱导NLRP3炎性小体和巨噬细胞对病原体的吞噬作用（Grishman等人，2012年；Hanamsagar等人，2012年）。

在本研究中，Ab-SK44株的EPS可以通过噬菌体尾刺蛋白ABTF2消化为五糖重复单元。通过核磁共振（NMR）和质谱（MASS）结构分析，该五糖主要由三糖{→3)Gal(β1?→?6)Glc(β1?→?3)GalNAc(α1→}组成，两个分支结构上分别连接着GlcNAc3NAcA4OAc和GlcNAc。Ab-SK44 EPS和TSP消化后的五糖都能通过Toll样受体4（TLR-4）刺激小鼠巨噬细胞Raw264.7释放白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。有趣的是，Ab-SK44 EPS和TSP消化后的五糖表现出相似的免疫调节活性；然而，当TSP消化后的五糖中的O-乙酰基减少时，这种活性会减弱。相反，去除O-乙酰基会对Ab-SK44 EPS的免疫活性产生轻微影响。这些结果表明，O-乙酰基主要决定了TSP消化后的五糖与TLR-4的结合方向，但酸基和O-乙酰基都参与了Ab-SK44 EPS与TLR-4的结合。

章节摘录

SK44多糖的提取

耐药临床株SK44来源于台北退伍军人总医院的病人。Ab-SK44外多糖的提取方法主要参考了以往的研究（Yang等人，2011年）。具体步骤包括：将该菌株在37°C下培养过夜于溶菌肉汤（lysygeny broth, LB）中，收集后用ddH₂O溶解细菌，通过加热裂解细菌，并通过离心去除细胞裂解物，然后对上清液进行进一步处理。

ABTF2对Ab-SK44多糖及其衍生物的酶促反应动力学

通过凝胶过滤色谱法，我们获得了可被噬菌体尾刺蛋白ABTF2消化的纯化Ab-SK44多糖（图1）。已证明ABTF2对Ab-SK44多糖具有糖苷酶活性（Yang等人，2017年），此处我们计划使用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid, DNS）测定法来评估ABTF2的酶促反应动力学，该方法适用于检测碳水化合物还原端的浓度。

结论

细菌细胞表面的多糖具有多样的结构和生物活性，使其成为治疗开发的理想靶点，例如糖缀合物疫苗或抗体疗法。在临床上，鲍曼不动杆菌是一种高毒力的病原菌，而Ab-SK44株分布广泛。为了对抗这种病原菌，我们利用噬菌体尾刺蛋白ABTF2研究了Ab-SK44多糖的特性。

CRediT作者贡献声明

Tzu-Yin Huang：研究、数据分析、概念构建、初稿撰写。Yen-Ju Yang：研究、数据分析。Boh-Woon Tay：研究、数据分析。Chun-Ting Lin：方法学设计、研究、数据分析。Shih-Hsiung Wu：指导、资源协调、研究资助、数据管理、概念构建、审稿与编辑。I-Ming Lee：研究、数据分析。

利益冲突声明

无。

致谢

本研究的资金支持来自国家科学技术委员会（National Science and Technology Council, NSTC；编号：NSTC 113-2320-b-B-110-003）。