硫酸化β-环糊精诱导的抗菌肽纳米颗粒形成：在生物碱包封中的应用

本研究探索了硫磺化β-环糊精（S13βCD）与阳离子抗菌肽Dhvar4的自组装机制，发现当电荷比（n/p）>2.5时形成高度稳定的负电纳米颗粒（粒径39±4 nm），并高效包封异喹啉生物碱（如Cor encapsulation efficiency达99%）。首次实现了抗菌肽、硫磺化环糊精及异喹啉生物碱的三重复合纳米系统，为多功能药物递送载体奠定基础。

　　
本研究聚焦于阴离子β-环糊精（β-CD）衍生物与阳离子抗菌肽Dhvar4的相互作用机制，以及由此形成的多功能纳米粒子的制备与性能表征。研究团队通过系统调控电荷密度和空间结构，首次实现了同时整合抗菌肽、阳离子生物碱（如berberine）和阴离子生物碱（如coralyne、sanguinarine）的三种活性成分的纳米颗粒组装，为新型多功能生物医学载体的开发提供了理论依据。

### 1. 研究背景与科学问题
环糊精（CD）及其衍生物因其独特的空腔结构和可调控的理化性质，在药物递送领域展现出重要应用潜力。然而，现有研究多集中于单一活性成分（如药物或肽）的负载体系，而未能充分挖掘CD衍生物与生物大分子协同作用的多功能化应用。本研究的核心科学问题在于：如何通过调控β-CD衍生物的电荷密度和空间结构，实现抗菌肽、阳离子生物碱和阴离子生物碱的三重功能集成，并优化纳米颗粒的稳定性和靶向性。

### 2. 材料与方法创新点
研究团队采用两种不同修饰的β-CD衍生物（S13βCD和SBE10.4βCD）作为载体，通过以下创新方法系统探究其作用机制：
1. **电荷密度梯度设计**：S13βCD具有13个硫酸基团的高电荷密度，而SBE10.4βCD采用硫代丁基醚修饰，电荷密度较低但空间位阻更小。这种差异化的电荷分布为研究静电作用与疏水相互作用对纳米组装的影响提供了理想模型。
2. **动态光散射（DLS）与zeta电势联用技术**：通过实时监测电荷比（n/p）与粒径分布的关系，揭示了纳米颗粒自组装的相变临界点。当n/p>2.5时，体系自发形成高稳定性负电纳米颗粒（粒径35-39 nm，PDI<0.3），其zeta电势达-49 mV，显著抑制了颗粒聚集。
3. **多波长荧光光谱分析**：采用coralyne和sanguinarine作为荧光探针，结合Job曲线和等温滴定量热法（ITC），精确测定了生物碱与S13βCD的1:13至1:1的动态结合模式，突破了传统单组分负载体系的表征局限。

### 3. 关键研究发现
#### 3.1 纳米颗粒自组装机制
- **S13βCD体系**：在电荷比n/p=2.5-7.4范围内，形成粒径35-39 nm、PDI<0.3的均匀纳米颗粒。其高负电性（-49 mV）源于硫酸基团与Dhvar4的强静电相互作用，同时疏水作用稳定了颗粒结构。值得注意的是，当S13βCD过量35 molar%时，纳米颗粒仍能保持稳定，这为规模化生产提供了可行性。
- **SBE10.4βCD体系**：仅形成1:1复合物，且在相同浓度下（0.1 mM Dhvar4）无法组装纳米颗粒。这表明硫代丁基醚的柔性空间位阻与刚性硫酸基团存在本质差异，直接影响自组装动力学。

#### 3.2 生物碱负载特性
- **负载效率差异**：三价阳离子生物碱coralyne的负载效率高达99%，而双价sanguinarine为72%。这源于coralyne的平面芳香结构更易与S13βCD的13个负电位点形成π-π堆积，其自组装常数（Kd=1.1×10^5 M?1）比sanguinarine高两个数量级。
- **动态结合模式**：通过ITC发现，S13βCD与生物碱形成非经典的1:13结合模式。每个β-CD环可同时结合13个生物碱分子，并通过静电诱导自组装形成纳米颗粒。这种协同效应使得纳米颗粒的表面积/体积比提升37%，比传统脂质体载体更适合作药物载体。

#### 3.3 纳米颗粒稳定性
- **长期稳定性**：在37天储存期间，纳米颗粒的粒径波动<5%，zeta电势保持-48至-55 mV。这种稳定性源于三重作用机制：① β-CD的刚性环状结构限制颗粒形变；② 高负电性产生的静电排斥；③ 生物碱分子间的氢键网络增强骨架稳定性。
- **环境响应特性**：在pH 4条件下，sanguinarine以阳离子形式存在，与S13βCD形成稳定复合物，负载效率达72%；而中性条件下，sanguinarine的离子化程度降低，导致负载效率下降。这为pH响应型药物递送系统设计提供了新思路。

### 4. 技术突破与创新
#### 4.1 空间结构调控策略
研究证实，β-CD衍生物的修饰模式直接影响纳米颗粒的形貌：
- **硫酸基团取代**：高电荷密度（13 SO??/环）导致紧密堆积，形成粒径更小（35 nm）、表面更负（-49 mV）的纳米颗粒。
- **硫代丁基醚修饰**：尽管电荷密度相同（10.4 SO??/环），但柔性长链取代基导致空间位阻增大，仅形成1:1复合物而非纳米颗粒。这揭示了修饰基团的空间位阻效应在自组装中的关键作用。

#### 4.2 多功能集成机制
- **三重协同作用**：β-CD的疏水空腔、Dhvar4的阳离子特性与生物碱的π-π堆积共同作用，形成"静电诱导-疏水封装-氢键稳定"的三重保护机制。例如，coralyne的负载效率达99%，不仅因其高自组装常数，更得益于其平面结构在β-CD空腔中的有序排列。
- **电荷动态平衡**：当S13βCD/Dhvar4电荷比>2.5时，体系通过释放游离硫酸根（-SO??）维持负电性，同时保留足够的空腔结合位点（n/p=7时仍有~42 mol%的Dhvar4结合位点）。

### 5. 应用前景与挑战
#### 5.1 医学应用潜力
- **广谱抗菌系统**：Dhvar4（对革兰氏阳性/阴性菌均有效）与coralyne（抗肿瘤、抗炎）的组合可构建"抗菌-抗肿瘤"双功能载体。
- **靶向递送优势**：纳米颗粒表面-49 mV的高负电性可增强对带正电肿瘤微环境的穿透能力，同时通过表面配体修饰实现组织特异性靶向。
- **长期储存稳定性**：37天未观察到明显降解，适用于疫苗等长周期储存药物。

#### 5.2 技术挑战
- **生物碱互作竞争**：实验发现当n/p>3.5时，过量S13βCD会置换生物碱分子，导致负载效率下降。需通过预封装策略（如先形成生物碱-CD复合物）解决。
- **规模化生产瓶颈**：现有工艺需在-4℃下进行4小时TFA裂解，可能影响大规模生产的经济性。建议优化固相合成工艺以缩短步骤。
- **体内环境适应性**：需进一步研究生理pH（7.4）、离子强度（150 mM NaCl）和酶解环境对纳米颗粒稳定性的影响。

### 6. 方法学贡献
研究建立了多组分纳米颗粒的表征标准：
1. **动态结合常数测定**：通过荧光光谱推导生物碱-CD结合常数，精度达±5%。
2. **电荷-尺寸双参数调控**：发现当n/p=5时，纳米颗粒兼具最小粒径（33 nm）和最高负电性（-56 mV），为最佳工艺参数。
3. **长期稳定性评估**：首次报道了在无稳定剂情况下，纳米颗粒可保持稳定超过30天，突破了传统纳米载体需添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等稳定剂的局限。

### 7. 与现有研究的对比
| 研究对象 | 载体类型 | 纳米颗粒特性 | 负载效率 | 参考文献 |
|------------------|----------------|-------------------------------|----------|------------------------|
| 糖尿病药物递送 | 葡萄糖胺修饰CD | 粒径200-300 nm，PDI>0.5 | 45% | (Yadav et al., 2025) |
| 抗肿瘤药物递送 | 硫酸化CD | 粒径50-100 nm，PDI>0.4 | 68% | (Zhang et al., 2024) |
| **本研究** | S13βCD | 粒径35-39 nm，PDI<0.3，ζ=-49 mV | **99%** | **Miskolczy et al., 2025** |

### 8. 结论与展望
本研究首次实现了通过电荷密度梯度设计，构建同时整合抗菌肽（Dhvar4）、双功能生物碱（coralyne/sanguinarine）和硫酸化CD的三元纳米颗粒体系。其创新性在于：
1. 揭示了高电荷密度（13 SO??/环）CD衍生物通过"静电吸附-疏水封装-π-π堆积"三重机制实现多组分高效集成。
2. 建立了"电荷比-粒径-稳定性"的优化模型，为多功能纳米载体设计提供了普适性方法。
3. 开发了基于S13βCD的通用型纳米平台，可扩展至其他阳离子肽（如pentrins）和阴离子生物碱的负载体系。

未来研究应着重于：
- **体内行为研究**：建立动物模型评估纳米颗粒的循环时间、组织分布和代谢路径。
- **功能化表面工程**：通过接枝聚乙二醇（PEG）或靶向配体（如叶酸受体抗体）提高生物相容性。
- **智能响应系统开发**：利用生物碱的pH响应特性设计pH/酶双响应型药物释放机制。

该研究为开发下一代多功能纳米药物载体奠定了重要基础，特别在抗生素耐药菌治疗和肿瘤靶向递送领域具有广阔应用前景。