从Menispermum dauricum中鉴定并表征参与苯基异喹啉生物碱生物合成的甲基转移酶的全基因组范围分析

苯基异喹啉生物碱（BIAs）的甲基转移酶（OMTs/NMTs）功能及结构多样性研究。基于基因组挖掘，鉴定出75个OMT和88个NMT基因，功能验证发现MdOMT1、MdOMT11和MdNMT3在BIAs的O/N-甲基化中起关键作用，揭示其底物特异性及动力学差异，为合成生物学生产高价值BIAs提供理论依据。

　　
### 马兜铃科植物苯基异喹啉生物碱甲基转移酶的功能解析与合成生物学应用

#### 1. 研究背景与科学意义
苯基异喹啉生物碱（BIAs）是一类广泛分布于罂粟科、毛茛科、黄连科等植物中的天然产物，其结构多样性和显著的生物活性（如镇痛、抗菌、抗肿瘤等）使其成为天然药物研究和合成生物学的重要靶点。然而，BIAs复杂的化学结构使其化学合成难度极大，而植物中甲基转移酶（OMTs/NMTs）的精准调控被认为是实现结构多样化的关键步骤。

本研究以药用植物 *Menispermum dauricum* 为研究对象，系统解析其基因组中75个OMTs和12个NMTs的功能。通过基因组挖掘、体外酶活测试及结构生物学分析，首次鉴定了4个关键酶（MdOMT1、MdOMT11、MdNMT3和MdOMT10），揭示了它们在BIAs甲基化过程中的特异性作用，为人工合成高附加值BIAs提供了理论依据和技术工具。

#### 2. 研究方法与技术路线
研究采用多组学整合策略，结合基因组学、转录组学、蛋白组学和结构生物学手段，具体步骤如下：

**2.1 基因组筛选与进化分析**
基于已发表的 *M. dauricum* 基因组数据，通过HMMER模型和BLASTp算法，从其26条染色体中共鉴定出75个OMTs和12个NMTs。通过染色体定位和同源基因比对，发现：
- OMTs主要分布于12条染色体，其中MdOMT1、MdOMT10、MdOMT11位于6号和13号染色体；
- NMTs呈现更集中的分布模式，MdNMT3和MdNMT5与已报道的C. chinensis NMTs存在同源关系；
- 基因家族中存在显著的重复扩张事件，尤其是MdOMT10和MdNMT3的基因对可能起源于全基因组加倍（WGD）。

**2.2 蛋白表达与酶活验证**
通过qPCR和RNA测序技术，筛选出6个高表达候选基因（FPKM>100），包括MdOMT1、MdOMT11和MdNMT3。采用大肠杆菌异源表达系统，纯化目标蛋白后进行体外酶活测试：
- **MdOMT1**：催化1-BIAs（如reticuline）的C7-OH和tetrahydroprotoberberines（如scoulerine）的C2-OH甲基化；
- **MdOMT11**：专一性催化scoulerine的C9-OH甲基化；
- **MdNMT3**：实现1-BIAs（如coclaurine）的N2位和tetrahydroprotoberberines（如scoulerine）的N7位甲基化。

**2.3 结构生物学解析**
利用AlphaFold3预测MdOMT1和MdOMT11的三维结构，结合AutoDock Vina分子对接模拟发现：
- **MdOMT11**的活性口袋呈狭长结构，SAM结合位点的距离（4.3?）显著短于MdOMT1（4.7?），使其对C9-OH位点的识别更精准；
- MdOMT1的口袋体积更大，允许其催化不同尺寸的BIAs（如1-BIAs和tetrahydroprotoberberines）；
- MdNMT3的口袋深度较浅，但N-甲基供体（SAM）与底物结合界面形成氢键网络，增强催化稳定性。

#### 3. 关键发现与机制解析
**3.1 OMTs的甲基化特异性**
- **MdOMT1**：展示广泛的底物适应性，可催化1-BIAs（如reticuline、coclaurine）的C7-OH和tetrahydroprotoberberines（如scoulerine）的C2-OH甲基化。例如，催化reticuline生成laudanosine（C7-OH和3′-OHI位同时甲基化）。
- **MdOMT11**：高度特异性的S9-OH甲基化酶，仅催化scoulerine等四氢原小檗碱类化合物。
- **MdOMT10**：作为6OMT的同源酶，专一催化norcoclaurine的C6-OH甲基化，但无其他位点活性。

**3.2 NMTs的底物多样性**
- **MdNMT3**：具有双重功能，既能催化1-BIAs（如coclaurine）的N2位甲基化，又能催化tetrahydroprotoberberines（如scoulerine）的N7位甲基化。这种跨类别的甲基化能力可能源于其SAM结合口袋的柔性调节。
- **MdNMT5**：与C. chinensis的CNMTs同源，专一催化1-BIAs的N2位甲基化，为合成berberine类生物碱提供关键酶。

**3.3 基因进化与功能分化**
- **全基因组加倍（WGD）事件**：导致MdOMT10/MdOMT35和MdNMT3/MdNMT12等基因对的分化。其中MdOMT35和MdNMT12因转录沉默可能失去功能。
- **正向选择分析**：在植物进化过程中，OMTs家族的特定氨基酸位点（如Cys102、Glu117）发生非中性突变，导致底物结合口袋构象改变，形成功能分化基础。

#### 4. 合成生物学应用前景
本研究成果为人工合成BIAs提供了关键工具：
1. **代谢工程菌株构建**：将MdOMT1、MdOMT11和MdNMT3导入酵母或大肠杆菌，可分别实现：
- 1-BIAs的C7-OH和C2-OH双甲基化；
- tetrahydroprotoberberines的C9-OH特异性甲基化；
- N2和N7位联合甲基化。
2. **高价值化合物合成**：
- 利用MdOMT1催化reticuline生成laudanosine（抗肿瘤活性成分）；
- 通过MdOMT11/SOMT组合实现scoulerine的C9-OH和C2-OH顺序甲基化，生成高附加值tetrahydroprotoberberines衍生物；
- MdNMT3为合成magnocurarine（强心苷前体）提供关键酶。
3. **结构导向酶设计**：基于分子对接结果，对MdOMT1的口袋进行理性改造，可提升其对larger substrates（如bisBIAs）的催化效率。

#### 5. 研究局限与未来方向
- **底物范围局限**：目前未发现催化bisBIAs甲基化的OMTs，需进一步挖掘基因库；
- **立体化学调控**：现有酶主要催化S构型产物，需研究手性中心控制机制；
- **代谢流优化**：需结合动态转录组数据，优化酶在异源系统中的表达比例。

#### 6. 结论
本研究首次系统解析了 *M. dauricum* 中OMTs/NMTs的功能多样性，揭示了：
1. MdOMT1作为多功能甲基化酶，可在不同BIA骨架上实现C7-OH和C2-OH的精准定位；
2. MdOMT11通过口袋空间优化，实现对长链四氢原小檗碱类化合物的特异性催化；
3. MdNMT3的跨类甲基化能力为合成双取代BIAs（如digitoxin）提供了新途径。

这些发现不仅深化了植物次生代谢理论，更为合成生物学提供了高特异性酶工具包，对开发可持续的BIAs生物合成平台具有重要指导意义。